Профессиональное решение
для инженеров-конструкторов и проектировщиков

     
МУК 4.2.1955-05

     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод выявления и определения бактерий рода
Salmonella и Listeria monocytogenes на основе
гибридизационного ДНК-РНК анализа

Дата введения: с момента утверждения



1. РАЗРАБОТАНЫ: ГУ научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян - руководитель, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина, А.М.Григорьев, И.Б.Быкова, И.М.Нитяга); ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (В.Г.Нестеренко); Центром госсанэпиднадзора в г.Москве (Н.Я.Салова, З.Г.Малышева); при участии Санкт-Петербургского ГУ "Центр контроля качества товаров (продукции), работ и услуг" (Н.И.Лебедева, Л.Б.Гамова, М.С.Колосова) и фирмы ООО "Ниармедик плюс" (С.В.Юров, Т.Б.Макарова, Д.О.Газдиев, А.Б.Швецов).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ 22 февраля 2005 г. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко.

3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН временных методических указаний МУК 4.2.1840-04 "Метод экспрессного выявления бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes в пищевых продуктах и продовольственном сырье за 24 часа с использованием твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-рРНК анализа", утвержденных 29.02.04.

     ВНЕСЕНО Дополнение N 1, утвержденное и введенное в действие Главным государственным санитарным врачом РФ c 06.12.2010

     Дополнение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 год



1. Введение


Проведение контроля пищевых продуктов и продовольственного сырья традиционными методами микробиологического анализа на наличие патогенных микроорганизмов - малоизученных возбудителей новых и вновь возникших заболеваний (Listeria monocytogenes, антибиотикорезистентных сальмонелл, энтерогемморагических эшерихий) связано с такими проблемами, как трудоемкость, длительность и недостаточная специфичность используемых методик.

Последнее обусловлено тем, что в качестве тестов идентификации, входящих в стандартизованные методы анализа, в настоящее время используют в основном характеристики метаболических свойств возбудителей, зачастую не позволяющие провести четкую дифференциацию патогенных представителей искомых родов и видов от непатогенных, имеющих одинаковое с патогенами фенотипическое выражение. Это снижает достоверность результатов анализа, осложняет оценку распространенности патогенов в пищевых продуктах и сырье и не гарантирует от необоснованных браковок продукции.

Наиболее достоверными в последние годы признаются методы генотипического анализа культур, выделенных на селективных питательных средах, основанные на выявлении кодируемых признаков патогенности или анализе последовательностей рибосомальной ДНК (16S, 26s pРНК). В связи с этим внедрение высокоспецифичных методов анализа и экспрессных диагностических тест-систем в официальные схемы санитарно-микробиологического контроля пищевых продуктов становится насущной необходимостью, которая позволит повысить эффективность работы и рационализировать ресурсы контрольных органов.

2. Общие положения и область применения

2.1. Настоящие методические указания устанавливают метод ускоренного выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и в смывах с поверхностей оборудования и инвентаря предприятий по производству пищевых продуктов, а также методы ускоренной (за 24 ч) идентификации культур, выделенных из указанных объектов и подозрительных на принадлежность к Listeria monocytogenes и бактериям рода Salmonella, на основе твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием.

2.2. Методы могут применяться в качестве альтернативных классическим бактериологическим методам лабораторных исследований для целей экспрессного выявления бактерий рода Salmonella и/или подтверждения принадлежности выделенных микробиологическими методами культур к бактериям рода Salmonella и Listeria monocytogenes при контроле пищевых продуктов и состояния поверхностей предприятий по производству пищевых продуктов.

2.3. Предлагаемый метод ускоренного выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и на поверхности оборудования и инвентаря предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе, или в определенном объеме смыва с поверхности.

2.4. При исследовании пищевых продуктов и состояния оборудования и инвентаря предприятий по производству пищевых продуктов на наличие патогенных микроорганизмов Listeria monocytogenes методами классического микробиологического анализа, метод гетерогенной твердофазной ДНК-РНК гибридизации может применяться для идентификации культур листерий после этапа их выделения на селективных дифференциально-диагностических средах.

2.5. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 02.01.00 N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов", Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.

2.6. Методические указания рекомендованы для применения в лабораториях учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за производством, хранением и оборотом пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, при проведении гигиенической оценки и выдаче санитарно-эпидемиологических заключений, а также при проведении санитарно-эпидемиологических расследований заболеваний, имеющих пищевой путь передачи; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья; в организациях, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного производства и выпуска продукции.

2.7. Настоящие методические указания устанавливают также метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием. Метод может применяться в качестве дополнительного к классическим бактериологическим методам лабораторных исследований для целей выявления бактерий Listeria monocytogenes при контроле пищевых продуктов.

(Введен дополнительно, Доп. N 1).

2.8. Метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-2001 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.

(Введен дополнительно, Доп. N 1).

3. Сущность метода

3.1. Метод гетерогенного твердофазного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот основан на принципе гибридизации участка бактериального генома с закрепленным на твердофазном носителе (стенке пробирки) комплементарным к определяемой последовательности ДНК олигонуклеотидным зондом, меченым флюоресцентным красителем, и последующей детекции гибридов по степени их хемилюминесценции в приборе-люминометре.

3.2. Метод может выполняться в формате коммерчески доступных тест-систем (наборов), прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

3.3. Метод ускоренного выявления бактерий рода Salmonella предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов (пищевых продуктов или смывной жидкости) в специальные неселективные и селективные питательные среды, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером для денатурации бактериальной рибосомальной РНК, гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в набор "Люмипроб-24 Salmonella", хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.

При обнаружении положительных результатов присутствие бактерий рода Salmonella должно подтверждаться в соответствии с ГОСТ 30519-97 "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella".

3.4. Метод ускоренной идентификации культур, выделенных из пищевых продуктов и с поверхности оборудования и инвентаря пищевых производств по ГОСТ 30519-97 "Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella", ГОСТ Р 51921-2002 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes" или по МУК 4.2.1122-02 "Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах", и подозрительных на принадлежность к бактериям рода Salmonella и Listeria monocytogenes, предусматривает инкубирование культур для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером для денатурации бактериальной рибосомальной РНК, гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в состав наборов "Люмипроб-24 Salmonella" или "Люмипроб-24 Listeria monocytogenes", хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.

3.5. Мишенями в реакции ДНК-РНК гибридизации являются:

- для бактерий рода Salmonella - последовательность нуклеотидов в области ДНК, кодирующая продукцию рибосомальной РНК, строго специфичной для всех представителей рода Salmonella;

- для Listeria monocytogenes - последовательность ДНК, кодирующая продукцию токсического белка листериолизина-O - основного фактора патогенности возбудителя листериоза.

3.6. Метод выявления бактерий Listeria monocytogenes предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов молока и молочных продуктов в специальную селективную питательную среду, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером, денатурацию бактериальной рибосомальной РНК, гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в набор "Люмипроб-24 Listeria monocytogenes", хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.

(Введен дополнительно, Доп. N 1).

3.7. При обнаружении положительных результатов присутствие бактерий Listeria monocytogenes должно подтверждаться в соответствии с методами ГОСТ Р 51921-2002 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes" или МУК 4.2.1122-02 "Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах".

(Введен дополнительно, Доп. N 1).

3.8. Мишенью в реакции ДНК-РНК гибридизации для Listeria monocytogenes является последовательность ДНК, кодирующая токсический белок листериолизин-О - основной фактор патогенности Listeria monocytogenes.

(Введен дополнительно, Доп. N 1).

4. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды


4.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН±0,01

ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80 П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160±5)°С

ТУ 64-1-28-70-76*

________________

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру (37±1)°С

ТУ 64-1-1382-83

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру (41,5±1,0)°С

ТУ 64-1-1382-83

Баня водяная с подогревом (37±1)°С

ГОСТ 12026-76

Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100°С

ТУ 42-22-608-75

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС

ГОСТ 8284-78

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

ГОСТ 19569-89Е

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды

ГОСТ 6709-72

Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2", "Стомайкер" или других наименований, AES Lab., Cat. N AESAP 1066

Гомогенизатор типа "вортекс"

Штатив для 12-миллиметровых пробирок с держателем, "Europrobe", Cat. N Р08363086

Микропипетки на 200-1000 мкл, BIOHIT, Cat. N 720040 или "Ленпипет"

Мультистеппер, BIOHIT, Cat. N 730101

Диспенсер, BIOHIT, Cat. N 723046

Распределительная емкость - объем 1-2,5 л, BIOHIT

Люминометр для пробирок "Люмлайт" или "Люмлайт мини", "Europrobe", Cat. N EBLL01     

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

ТУ-16-535-84

Холодильник бытовой электрический

ГОСТ 16317-87

Пинцет медицинский

ГОСТ 21241-89

Ножницы медицинские

ГОСТ 21239-89

Скальпель хирургический, 15 см

ГОСТ 21240-89

Часы механические сигнальные

ГОСТ 3145-84

Электроплитка

ГОСТ 14919-83

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)


ТУ 64-1-2451-78

     

4.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости

ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные

ГОСТ 25336-82

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 5556-81

Пипетки, вместимостью 1, 2, 5 и 10 см

ГОСТ 29227-91

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Стекла предметные для микропрепаратов

ГОСТ 6672-75

Спиртовки лабораторные стеклянные

ГОСТ 23932-90

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100°С (цена деления шкалы 1°С)


ГОСТ 13646-68

Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов

ГОСТ 23932-90

Пакеты стерильные для гомогенизатора, AES Lab., Cat. N AES400/50G

Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности N 10, ГИСК им. Л.А.Тарасевича, МЗ РФ

Денситометр для бактериальных суспензий типа "Densi-La-Meter" или "Денсимат", ф. "Лахема", "BioMerieux"

Стандарт Макфарланда N 1, 2, 3, ф. "BioMerieux"

Петля бактериологическая калиброванная на 1 мкл, AES Lab., Cat. N AESDI100

Доступ к полной версии документа ограничен
Этот документ или информация о нем доступны в системах «Техэксперт» и «Кодекс».