Действующий

ГОСТ 10444.11-2013 (ISO 15214:1998) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества мезофильных молочнокислых микроорганизмов

     9 Метод проведения испытания

9.1 Проба для анализа, исходная суспензия и разведения

По [1]-[4], ГОСТ 26669 и соответствующего стандарта на конкретный продукт.

9.2 Инокуляция и инкубация

9.2.1 В каждую из двух стерильных чашек Петри переносят с помощью стерильной пипетки 1 см пробы для анализа, если продукт жидкий, или 1 см исходной суспензии в случае испытания продукта другой консистенции.

Если необходимо, повторяют процедуру, используя последующие десятичные разведения.

Примечание - Если ожидается рост большого числа молочнокислых бактерий, можно инокулировать только те разведения, которые необходимы для подсчета.

9.2.2 Заливают в каждую чашку Петри приблизительно 15 см плотной среды, которая приготовлена и охлаждена до температуры приблизительно 47°С на водяной бане (см. 6.4).

Тщательно перемешивают посевной материал со средой и дают смеси застыть на горизонтальной поверхности.

9.2.3. При поверхностном способе посева в каждую из двух чашек Петри с агаром переносят с помощью стерильной пипетки 0,1 или 0,2 см пробы для анализа, если продукт жидкий, или исходную суспензию в случае испытания продукта другой консистенции. Если необходимо, повторяют процедуру, используя последующие десятичные разведения.

Если для некоторых продуктов необходимо определить небольшое количество микроорганизмов, то пределы обнаружения могут быть увеличены в 10 раз в результате исследования 1,0 см пробы для анализа, если исходный продукт жидкий, или 1,0 см исходной суспензии для продуктов других консистенций. В этом случае распределяют 1 см инокулята или на поверхности большой чашки Петри (диаметром 140 мм) или на поверхности пяти маленьких чашек (диаметром 90 мм). В обоих случаях посевы проводят в двух повторностях, используя две большие чашки или десять маленьких чашек.

Примечание - Посев на поверхность в сочетании с инкубацией в анаэробных или микроаэробных условиях применяют вместо посева заливкой.


Ограничение доступа кислорода осуществляют одним из способов, указанных в ГОСТ 30425-97:

на застывшую плотную питательную среду в чашках Петри наливают второй слой расплавленной и охлажденной до (45±1) °С плотной среды в объеме приблизительно 5,0 см и оставляют для затвердения;

чашки Петри помещают в газовую среду, состоящую из 95% и 5% ;

чашки Петри помещают в анаэростат. Аппарат закрывают и создают вакуум 86,6-93,3 кПа;

в каждую пробирку с жидкой средой наслаивают стерильный жидкий парафин в количестве, необходимым для получения высоты столба, равным приблизительно 2 см.

Тщательно и быстро распределяют инокулят по поверхности чашки с агаром, не касаясь сторон чашки шпателем (см. 6.8). Используют новый стерильный шпатель для каждой чашки. Оставляют чашки с закрытыми крышками на 15 мин при температуре окружающей среды для впитывания инокулята агаром.

9.2.4 Переворачивают засеянные чашки Петри (донышком вверх) и помещают в инкубатор (см. 6.3).

Посевы инкубируют при температуре (30±1)°С не более 5 сут. Допускается инкубировать посевы не более 3 сут при температуре (37±1)°С.

Необходимо избегать подсушивания агара во время инкубации, чтобы среда не угнетала рост микроорганизмов.

9.2.5 При определении количества молочнокислых микроорганизмов по методу НВЧ или при выявлении молочнокислых микроорганизмов в определенной анализируемой пробе продукта проводят посевы в жидкую среду. При определении количества молочнокислых микроорганизмов по методу НВЧ каждую анализируемую пробу исследуемого продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в пробирки с жидкой средой, высевают не менее трех последовательных анализируемых проб исследуемого продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.

При выявлении молочнокислых микроорганизмов в определенной анализируемой пробе продукта, эту анализируемую пробу высевают в жидкую среду. Соотношение количества высеваемого продукта к количеству среды должно быть не менее 1:9.

Если при внесении продукта цвет среды меняется (за счет изменения величины рН), то его восстанавливают с помощью стерильных растворов щелочи и кислоты.

Посевы на жидких средах инкубируют по 9.2.4, ежедневно просматривают, инкубирование посевов прекращают при появлении видимых признаков роста. Рост молочнокислых микроорганизмов на жидкой среде сопровождается изменением цвета среды от фиолетового до желтого, помутнением среды или образованием осадка, возможно выделение газа.

Из пробирок с признаками роста проводят пересев петлей на плотную среду так, чтобы получить рост изолированных колоний.

9.2.6 Предварительный подсчет количества выросших колоний на плотных средах проводят через 48 ч. После термостатирования посевов по 9.2.4 отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 типичных колоний. Характеристика типичных для молочнокислых микроорганизмов колоний приведена в приложении А.

9.2.7 Для подтверждения принадлежности типичных колоний к молочнокислым микроорганизмам отбирают из посевов не менее 5 колоний. Принадлежность каждой отобранной колонии к определенным микроорганизмам устанавливают по отношению к окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы, дополнительно при идентификации бактерий рода Leuconostoc определяют наличие капсул, при идентификации стрептококков рода Streptococcus отсутствие роста в мясо-пептонном бульоне с 9,6 ед. рН и в мясопептонном бульоне с 6,5% .

9.2.7.1 Для определения отношения микроорганизмов к окраске по Граму из колоний приготавливают мазки, окрашивают их по ГОСТ 30425 и микроскопируют. Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегерсена. Для этого на предметном стекле в капле 3%-ного водного раствора калия гидроокиси эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с плотной среды. Если через несколько секунд взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным бактериям. У грамположительных бактерий слизистых нитей не образуется.

9.2.7.2 Для изучения подвижности микроорганизмов из колоний приготавливают препараты методом висячей или раздавленной капли и микроскопируют. Результаты микроскопирования оценивают в соответствии с приложением Б. Подвижность допускается определять посевом в полужидкие среды.