МУ 2.3.2.1830-04 Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов

4. Микробиологическая оценка ГММ, используемых для производства пищевой продукции

Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяется экспертом центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

4.1. Сравнительный анализ фенотипических свойств ГММ,
штамма-реципиента или референтного штамма

4.1.1. Сущность метода

Сравнительный анализ фенотипических свойств основан на идентификации основных фенотипических свойств исследуемого ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма того же вида для определения стабильности фенотипических признаков.

Оптимальными методами исследования фенотипических свойств являются методы идентификации микроорганизмов с помощью диагностических панелей, выпускаемых отечественными и зарубежными производителями и разрешенными к использованию в установленном порядке. Данные системы одноразового пользования предназначены для определения биохимической активности и последующей идентификации в течение 18-24 часов. Дополнительными методами исследования фенотипических свойств являются чувствительность к антибиотикам, к бактериофагам (для некоторых видов ГММ).

4.1.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и
питательные среды

Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения исследований фенотипических свойств в соответствии с данным документом. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя.

Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.

Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4.1.3. Методика проведения исследования

4.1.3.1. Выделение ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма

Чистую культуру ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма выделяют, пользуясь общепринятыми в микробиологии методами на рекомендованной для данного вида ГММ и штамма-реципиента питательной среде. Например, выделение чистой культуры ГММ вида термофильных стрептококков должно осуществляться со среды типа М17 по ГОСТ 51331-99, а лактобактерий - со среды MRS по ГОСТ 51339-99.

4.1.3.2. Постановка реакции биохимической идентификации ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма

Из чистой 18-24 часовой культуры готовят суспензию в стерильной дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от исследуемого вида ГММ и штамма-реципиента. Неправильно приготовленная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов.

Параллельно суспензию ГММ, штамма-реципиента или контрольного штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов.

Планшет для идентификации извлекают из полиэтиленовой упаковки и на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма.

Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0,1-0,2 см) в зависимости от фирмы-изготовителя и вида исследуемого ГММ и штамма-реципиента.

После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное вазелиновое масло полностью закрывающее внесенную суспензию клеток для создания анаэробных условий.

После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5-24 часа при оптимальной температуре для исследуемого вида ГММ (например, 25-28 °С дрожжи, 42 °С - лактобациллы).

По окончании инкубации проверяют рост и чистоту культуры методом посевов на селективные жидкие или плотные питательные среды.

В некоторые лунки (например, ферментация индола) могут быть добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3-5 часов и через 18-24 часов. Результаты учитывают визуально с помощью таблицы "Интерпретация реакций" и заносят в бланки.