ГОСТ 29184-91

Группа Н09

      

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

Food products. Methods for detection and quantity determination of family Enterobacteriaceae

     

MКC 07.100.30
ОКСТУ 9109

Дата введения 1993-01-01

     
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП), ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 23.12.91 N 2049

3. Настоящий стандарт соответствует ИСО 7402-1985 "Микробиология. Общее руководство для определения Enterobacteriaceae пo методу НВЧ подсчетом колоний" в части порядка проведения исследований

4. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

6. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий семейства Enterobacteriaceae и два метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и метод посева на поверхность селективно-диагностической среды.

Методы выявления и определения наиболее вероятного числа основаны на высеве продукта и (или) его разведений в жидкую селективную среду, инкубировании посевов при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч, пересеве выделенной культуры на поверхность селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам роста принадлежности выделенных колоний к бактериям семейства Enterobacteriaceae.

Метод определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae посевом на поверхность агаризованной среды основан на высеве 0,1 или 0,2 см продукта или его разведений на поверхность селективно-диагностической среды, инкубировании посевов при (37±1) °С в течение 24 ч, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к бактериям семейства Enterobacteriaceae.

Требования настоящего стандарта являются обязательными.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор проб и подготовка их к испытанию - по ГОСТ 26668 и ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);

________________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 (здесь и далее).

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический, обеспечивающий увеличение в 900-1000;

поплавки (трубки Дархема);

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;

бриллиантовый зеленый;

генцианвиолет;

диметил--фенилендиамин;

желчь говяжья сухая или натуральная;

метиловый фиолетовый;     

N,N,N',N'-тетраметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорид;

индикаторные бумажки на оксидазу, выпускаются Дагестанским НПО "Питательные среды" и Горьковским НИИ эпидемиологии и микробиологии.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов

3.1.1. Щелочной раствор бромкрезолового пурпурного концентрацией 10 г/дм: 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в фарфоровую ступку с 19 см раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм и после растворения добавляют 80 см дистиллированной воды. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

3.1.2. Раствор бриллиантового зеленого концентрацией 5 г/дм: 0,5 г бриллиантового зеленого переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

3.1.3. Раствор генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового концентрацией 10 г/дм: 1 г одной из анилиновых красок переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки.

3.1.4. Растворы и реактивы для окраски по Граму по ГОСТ 10444.1.

3.1.5. Растворы для определения оксидазы готовят непосредственно перед применением.

3.1.5.1. Раствор N,N,N',N'-тетраметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида концентрацией 10 г/дм: 1 г реактива переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде температурой 10-15 °С.

3.1.5.2. 30-40 мг -нафтола растворяют в 2,5 см ректификованного этилового спирта, добавляют 7,5 см дистиллированной воды и 40-60 мг диметил-n-фенилендиамина.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Среда Кесслера: 10,0 г пептона, 2,5 г глюкозы, 5,0 г сухой говяжьей желчи или 50 см натуральной желчи, 2,0 см  раствора генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового, приготовленных по п.3.1.3, добавляют к 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,3±0,2), разливают по 10 см в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре (114±1) °С.

3.2.2. Буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью: 10,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 6,45 г двузамещенного фосфорнокислого безводного натрия, 2,0 г однозамещенного фосфорнокислого безводного калия, 20,0 г сухой говяжьей желчи или 200 см натуральной желчи, 3,0 см раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по п.3.1.2, добавляют к 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы он составлял при 25 °С (7,2±0,1), после чего среду доводят до кипения.

Среда не подлежит стерилизации в автоклаве, ее разливают по 10 см в стерильные пробирки с поплавками.

3.2.3. Бульон Мак-Конки: 20,0 г пептона, 10,0 г глюкозы, 5,0 г хлористого натрия, 5,0 г сухой говяжьей желчи или 50 см натуральной желчи, 1,0 см раствора бромкрезолпурпура, приготовленного по п.3.1.1, добавляют к 1000 см дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1), разливают по 10 см в пробирки с поплавками и стерилизуют 15 мин при температуре (121±1) °С.

3.2.4. Среда Кода выпускается Дагестанским НПО "Питательные среды", готовится по прописи, указанной на этикетке, но при приготовлении на 1 дм среды добавляют 10,0 г глюкозы.

3.2.5. Среды двойной концентрации готовят по пп.3.2.1-3.2.4, но при приготовлении берут удвоенную массу (объем) ингредиентов, кроме дистиллированной воды, и разливают в посуду с учетом последующего количества добавляемого продукта.

3.2.6. Среда Эндо выпускается Дагестанским НПО "Питательные среды" и готовится по прописи, указанной на этикетке.

3.2.7. Среду Гисса готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, выпускаемую Дагестанским НПО "Питательные среды", и при этом она готовится по прописи, указанной на этикетке.

3.2.8. Мясо-пептонный агар по ГОСТ 10444.1.

3.2.9. Среда, приготовленная из сухого питательного агара, выпускаемого Дагестанским НПО "Питательные среды".

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Определение количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

4.1.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см) предполагаемое количество бактерий семейства Enterobacteriaceae или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкретный продукт.

4.1.2. При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству высеваемого продукта в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с одной из питательных сред по пп.3.2.1-3.2.4.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:9.

4.1.3. При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae посевом на агаризованную среду по 0,1 или 0,2 см навески продукта или его разведения наносят на поверхность двух параллельных чашек Петри с агаризованной средой по п.3.2.6. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.

При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae методом мембранных фильтров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность среды Эндо, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

4.2. Определение присутствия (отсутствия) бактерий семейства Enterobacteriaceae

При определении присутствия (отсутствия) бактерий семейства Enterobacteriaceae в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред по пп.3.2.1-3.2.4.