ГОСТ 10444.9-88 Продукты пищевые. Метод определения Clostridium perfringens

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Выявление характерных колоний

4.1.1. Для проведения испытания отбирают объем (1±0,1) см подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости.

Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей (штрихом) на поверхность питательной среды.

4.1.2. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают глубинным методом по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают триптозо-сульфит-циклосериновым или сульфит-полимиксин-неомициновым агаром, или сахарным кровяным агаром по Цейсслеру, или агаром Вильсон-Блера. Содержимое чашек Петри быстро, осторожными круговыми движениями перемешивают. После застывания среды чашки подсушивают и заливают той же средой так, чтобы высота второго слоя питательной среды была не менее 4 мм.

4.1.3. Посевы на чашках Петри термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч в анаэростатах с разряжением 0,6-0,8 атм [(0,4-0,6)·10 Па] или в анаэробных условиях, указанных в ГОСТ 30425.

4.1.4. После окончания термостатирования отбирают те чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Подсчитывают количество выросших характерных колоний. Характеристика колоний С. perfringens на селективных питательных средах приведена в приложении.

Корректировку подсчета количества С. perfringens проводят после изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для С. perfringens.

4.2. Подтверждение принадлежности характерных колоний к С. perfringens.

4.2.1. Для подтверждения принадлежности обнаруженных колоний к С. perfringens отбирают произвольно не менее пяти, характерных для С. perfringens, колоний и пересевают их в жидкую (вязкую) среду для мезофильных анаэробных микроорганизмов (см. п.3.2.4).

Жидкие (вязкие) среды подготавливают к анализу по ГОСТ 30425.

Посевы термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч. Культуральную жидкость используют для изучения морфологических и биохимических свойств микроорганизмов.

4.2.2. Если колонии в посевах на чашках Петри растут в виде ковра или среди обнаруженных колоний много нетипичных для С. perfringens, то мазок из ковра или кажущиеся характерные колонии пересевают, как указано в п.4.2.1, в питательные жидкие (вязкие) среды для мезофильных анаэробов и термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч, полученную культуральную жидкость вновь высевают на чашки Петри (см. 4.1.2) так, чтобы получить раздельные колонии, предназначенные для определения культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, предположительно относящихся к С. perfringens. Питательные среды, используемые для вторичного посева на чашки Петри, не должны содержать циклосерина. Вторичные посевы термостатируют, как указано в п.4.1.3.

4.2.3. Из посевов (см. пп.4.2.1, 4.2.2) готовят препараты, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425 и микроскопируют. С. perfringens представляет собой грамположительные палочки размером 0,9-1,3х3,0-9,0 мкм, плохо или необразующие в посевах споры. Палочки с закругленными концами располагаются в одиночку, попарно, в виде цепочек штакетообразных скоплений.

В спороносных палочках спора расположена субтерминально. В посевах устанавливают отсутствие каталазы по ГОСТ 30425.

4.2.4. Культуры, указанные в пп.4.2.1, 4.2.2, высевают в пробирки с лакмусовым молоком. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 8-12 ч.

С. perfringens вызывает бурную ферментацию лактозы с образованием газа, редукцию лакмуса, коагуляцию молока с последующим его свертыванием и образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета в верхней части пробирки и просветлением сыворотки.

При инкубации посевов при температуре (45±1) °С характерную реакцию ферментации молока С. perfringens вызывают уже через 3-5 ч.

4.2.5. Исследуемую культуру высевают бактериологической петлей уколом в полужидкую питательную среду для изучения подвижности и редукции нитратов. Посев термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. С. perfringens неподвижен, он растет по ходу линии посева, не вызывая помутнения всей среды. После учета подвижности в эту же пробирку вносят реактив на нитриты. Редукцию нитратов оценивают по ГОСТ 10444.8. Культуры, которые показывают слабую реакцию на нитриты (т.е. розовый цвет), не учитывают, так как С. perfringens стойко дает сильную и немедленную реакцию (красный цвет).

4.2.6. Исследуемую культуру высевают бактериологической петлей уколом в питательную среду (см. п.3.2.5) для определения способности к ферментации лактозы и разжижению желатина. Посев термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч. О ферментации лактозы свидетельствует желтое окрашивание среды и выделение пузырьков газа в толще среды. После учета ферментации лактозы пробирки с посевом выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 1 ч. Если среда вновь не застыла, то это свидетельствует о гидролизе желатина. При сохранении вязкости среды пробирку со средой вновь помещают в термостат с температурой (37±1) °С на 24 ч, охлаждают при температуре (4±2) °С и дают окончательную оценку способности выделенной культуры к гидролизу желатина.

С. perfringens ферментирует лактозу и, как правило, разжижает желатин.

4.2.7. Подвижность, редукцию нитратов, разжижение желатина допускается определять путем посева 6-8-часовой культуры, как указано в п.4.2.1 или 4.2.2 на среду Роберта. Среду непосредственно перед использованием прогревают 20 мин на кипящей водяной бане, охлаждают до застывания в холодильнике. В подготовленную среду посев проводят уколом. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24 ч, после этого посевы помещают на 20 мин в холодильник.

С. perfringens на среде Роберта образует прямую (вследствие неподвижности клеток) красную (вследствие редукции нитратов и появлению нитритов) линию, превращая среду в желеобразное состояние и не затвердевающую при температуре 2-4 °С в холодильнике (вследствие разжижения желатина).