ГОСТ 34430-2018 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения протеолитической активности

     7 Подготовка к анализу

7.1 Приготовление универсального буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм

7.1.1 Приготовление раствора уксусной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм (раствор А)

Концентрированную уксусную кислоту объемом 5,7 см разводят в 300 см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см, доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20°С и перемешивают.

Раствор хранят в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°С в течение 30 сут.

7.1.2 Приготовление раствора ортофосфорной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм (раствор В)

Ортофосфорную кислоту объемом 6,45 см разводят в 300 см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см, доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20°С и перемешивают.

Раствор хранят в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°С в течение 30 сут.

7.1.3 Приготовление раствора борной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм (раствор С)

Борную кислоту массой (6,1800±0,0200) г растворяют в 300 см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см, доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20°С и перемешивают.

Раствор хранят в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°С в течение 30 сут.

7.1.4 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 1,0 моль/дм

Гидроокись натрия массой (40,0000±0,1000) г растворяют в 500 см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см, доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20°С и перемешивают.

Раствор хранят в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°С в течение 14 сут.

7.1.5 Приготовление универсального буферного раствора

При смешивании равных объемов растворов А, В и С получают универсальный буферный раствор со значением (2,0±0,2) ед. рН, который используют для приготовления субстрата при определении протеолитической активности.

7.2 Приготовление буферных растворов для определения протеолитической активности в ферментных препаратах

7.2.1 Для кислых протеаз используют универсальный буферный раствор (см. 7.1.5).

7.2.2 Для слабокислых протеаз в конической колбе вместимостью 250 см к 100 см универсального буферного раствора (см. 7.1.5) добавляют 6,0 см раствора гидроокиси натрия (см. 7.1.4) молярной концентрации 1,0 моль/дм, получая буферный раствор со значением 4,7 ед. рН.

7.2.3 Для нейтральных протеаз в конической колбе вместимостью 250 см к 100 см универсального буферного раствора добавляют 10,0 см гидроокиси натрия, получая буферный раствор со значением 7,0 ед. рН.

7.2.4 Для щелочных протеаз в конической колбе объемом 250 см к 100 см универсального буферного раствора добавляют 14,0 см гидроокиси натрия, получая буферный раствор со значением 9,3 ед. рН.

7.2.5 Буферные растворы хранят в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°С в течение 3 сут.

7.3 Приготовление раствора гемоглобина с массовой долей 2,0% (субстрат)

2,5 г бычьего гемоглобина предварительно растирают в фарфоровой ступке. Навеску растертого гемоглобина массой (2,0000±0,0100) г взвешивают в стеклянном стакане вместимостью 100 см и растворяют в 50 см буферного раствора с соответствующим значением ед. рН по 7.2. После этого для получения субстрата к раствору гемоглобина добавляют (32,0000±0,1000) г карбамида. Содержимое стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят объем до метки буферным раствором с тем же значением рН и выдерживают в течение 1 ч при температуре 30°С для денатурации белка. Так как карбамид изменяет значение рН буфера, особенно в кислой и слабокислой зонах рН, для получения необходимого рН субстрата раствор гемоглобина готовят на буферном растворе с более низким значением рН в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Раствор гемоглобина хранят в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°С в течение 3 сут.