ГОСТ 33422-2015 Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (Переиздание)

     8 Подготовка к измерению

8.1 Приготовление градуировочных растворов йодтирозинов

Для определения йодтирозинов готовят градуировочные растворы индивидуального йодтирозина (МИТ или ДИТ) с массовой концентрацией 100 нг/см (раствор 1), 10 нг/см (раствор 2), 1 нг/см (раствор 3).

Взвешивают 10 мг индивидуального йодтирозина (МИТ или ДИТ), переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, добавляют 20%-ный раствор ацетонитрила до метки, помещают на 20-25 мин на ультразвуковую баню до полного растворения.

Для приготовления раствора 1 градуированной пипеткой или автоматическим дозатором отбирают 1 см приготовленного раствора индивидуального йодтирозина (МИТ или ДИТ), переносят в круглодонную колбу вместимостью 10 см, упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 60°C. Сухой остаток растворяют в 1 см смеси бутанола с хлористым ацетиленом, плотно закрывают пробкой со шлифом и ставят на водяную баню при температуре 60°C в течение 15 мин. Упаривают растворитель досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 10 см 20%-ного раствора ацетонитрила.

Для приготовления раствора 2 градуированной пипеткой или автоматическим дозатором в стеклянную виалу переносят 0,1 см раствора 1 и 0,9 см 20%-ного раствора ацетонитрила. Раствор тщательно перемешивают.

Для приготовления раствора 3 градуированной пипеткой или автоматическим дозатором в стеклянную виалу переносят 0,1 см раствора 1 и 0,9 см 20%-ного раствора ацетонитрила. Раствор тщательно перемешивают.

Растворы хранят в холодильнике при температуре (4±2)°C в течение 7 сут.

8.2 Приготовление растворов

8.2.1 Приготовление 20%-ного раствора ацетонитрила

В мерную колбу вместимостью 100 см добавляют 20 см ацетонитрила и доводят до метки дистиллированной водой

8.2.2 Приготовление буферного раствора трис-(гидроксиметил)-аминометана молярной концентрации 0,1 моль/дм (раствор ТрисHCl)

В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают 12,11 г трис-(гидроксиметил)-аминометана и доводят объем до метки дистиллированной водой. По каплям добавляют соляную кислоту, доводя активную кислотность до 8,0 ед. рН, контролируя рН-метром.

8.2.3 Приготовление смеси ацетонитрила с раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl)=0,1 моль/дм (4:1,8)

В мерную колбу вместимостью 100 см добавляют 70-80 см дистиллированной воды, с помощью механического дозатора приливают 0,85 см концентрированной соляной кислоты (=1,188 г/см) и доводят объем до метки дистиллированной водой. Ацетонитрил смешивают с раствором соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм в соотношении 4:1,8.

8.2.4 Приготовление смеси бутанола с хлористым ацетилом (4:1)

В 4 объема бутанола по каплям приливают один объем хлористого ацетила. Приготовление раствора проводят под вытяжной вентиляцией (в вытяжном шкафу), с охлаждением раствора проточной водой или льдом. Раствор готовят в небольших количествах перед анализом.

8.2.5 Приготовление подвижной фазы хроматографической системы

Для проведения хроматографического анализа используется двухкомпонентная подвижная фаза:

- элюент A: ацетонитрил - метанол (1:1);

- элюент B: 1%-ный раствор муравьиной кислоты (в мерную колбу вместимостью 1000 см приливают 900 см дистиллированной воды и добавляют 10 см муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной водой).

Перед проведением анализа элюенты дегазируют на ультразвуковой бане.

Готовые растворы хранят в колбах с притертыми пробками, при температуре (4±2)°C не более 1 мес.

8.3 Подготовка пробы

8.3.1 Предварительная подготовка пробы

Перед проведением анализа пробу предварительно высушивают на чашке Петри в сушильном шкафу при температуре (103±2)°C в течение 1 ч. Затем высушенную пробу обезжиривают по ГОСТ 23042 гексаном или петролейном эфиром в экстракционном аппарате Сокслета. Пробу взвешивают до и после предварительной подготовки с записью результата взвешивания в граммах до третьего десятичного знака.

8.3.2 Ферментативный гидролиз пробы

Пробу переносят в центрифужную пробирку и растворяют в буферном растворе Трис-HCI до массовой концентрации 2 мг/см (плохо растворимые пробы рекомендуется предварительно термостатировать на ультразвуковой бане с прогревом при 37°C до полного растворения), затем добавляют ферментный препарат (протеаза из Streptomyces griseus) в количестве, составляющем 1/10 от массы пробы белка. Инкубируют 16 ч при 37°C на водяной бане.

Гидролизат центрифугируют в течение 5 мин при 15000 об/мин для осаждения нерастворимых продуктов. Супернатант пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.