ГОСТ EN 14132-2013 Продукты пищевые. Определение охратоксина А в ячмене и жареном кофе. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта (Переиздание)
8 Анализ с помощью ВЭЖХ
8.1 Приготовление градуировочных растворов
Градуировку осуществляют в день проведения испытания перед хроматографическим анализом растворов проб или в случае изменения условий хроматографического анализа.
Готовят пять градуировочных растворов в соответствии с таблицей 1, для чего в мерные колбы вместимостью по 5 см пипеткой вносят различные объемы стандартного раствора по 4.23, объем содержимого в колбах доводят до метки дилюентом по 4.16, фильтрованным через мембранный фильтр.
Таблица 1 - Приготовление градуировочных растворов
Градуировочный раствор | Объем стандартного раствора по 4.23, взятый для приготовления градуировочного раствора, мм | Объем дилюента по 4.16, использованный для приготовления градуировочного раствора, мм | Массовая концентрация охратоксина А в градуировочном растворе, нг/см |
1 | 125 | 4875 | 0,5 |
2 | 250 | 4750 | 1,0 |
3 | 500 | 4500 | 2,0 |
4 | 1250 | 3750 | 5,0 |
5 | 2500 | 2500 | 10,0 |
8.2 Условия хроматографического анализа
Приведенные ниже параметры обеспечивают приемлемое качество хроматографического анализа при использовании аналитической колонки по 5.13.3 длиной 250 мм, внутренним диаметром 4.6 мм и диаметром частиц сорбента 5 мкм.
Скорость подачи подвижной фазы - 1,0 см/мин.
Параметры работы флуориметрического детектора: длина волны возбуждения 333 нм, длина волны эмиссии 460 нм.
Объем инжекции - 100 мм (
).
8.3 Идентификация пика аналита
Пик охратоксина А на хроматограмме раствора пробы идентифицируют по совпадению его времени удерживания с временем удерживания пика охратоксина А на хроматограммах градуировочных растворов. При возникновении сомнений в правильности идентификации пик охратоксина А на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавлением градуировочного раствора охратоксина А.
8.4 Количественное определение
Количественное определение проводят по методу внешнего стандарта. При этом либо осуществляют градуировку по одному градуировочному раствору, площадь или высота пика аналита на хроматограмме которого наиболее близки к площади или высоте пика аналита на хроматограмме раствора пробы, либо используют градуировочный график. В последнем случае проводят анализ нескольких градуировочных растворов, при этом необходимо, чтобы массовые концентрации охратоксина А в них находились в пределах линейного участка градуировочной зависимости.
Соблюдают одинаковые объемы инжекции при анализе раствора пробы и градуировочных растворов.
Если аналитический сигнал, относящийся к пику охратоксина А в растворе пробы, выходит за верхнюю границу диапазона градуировки, раствор пробы разбавляют в необходимой мере.