ГОСТ Р 53910-2010 (ИСО 10253:2006) Вода. Методы определения токсичности по замедлению роста морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin и Sceletonema costatum (Greville) Cleve

Приложение ДА
(обязательное)

Методы культивирования водорослей

ДА.1 Культивирование водорослей для метода А

ДА.1.1 Культивирование водорослей проводят в конических колбах вместимостью 250 см на питательной среде Гольдберга в условиях, соответствующих условиям проведения тестирования проб по 5.4.3.3.
     

    ДА.1.2 Культивируя водоросли, периодически обновляют маточную культуру, пересевая ее на свежеприготовленную питательную среду [см. А.1.2 (приложение А)] не реже одного раза в 10 сут. Обновление культуры проводят следующим способом: в стерильную колбу вместимостью 250 см со свежей питательной средой объемом 150 см над пламенем спиртовки вносят 15-20 см верхнего ростового слоя маточной культуры (содержимое исходной культуры при этом не перемешивают). После пересева колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком, перемешивают и выдерживают в условиях по 5.4.3.3. При этом плотность (численность) клеток водорослей в колбе должна составлять около 1,0·10-1,5·10 клеток/см. В течение 10 сут водоросли периодически перемешивают, встряхивая колбы вручную один-два раза в сутки.
     
     В случае замедления роста клеток водорослей к питательной среде добавляют витамин В (одну или две капли на 1 дм среды).
      

    ДА.1.3 Для тестирования используют культуру водорослей в экспоненциальной фазе роста и заданной плотности (численности) клеток водорослей. Для этого за 3 сут до начала тестирования в колбу вместимостью 250 см со свежей питательной средой объемом 100 см над пламенем спиртовки вносят 20 см суспензии водорослей из маточной культуры (см. ДА.1.2). Затем колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком, перемешивают вручную и выдерживают в условиях по 5.4.3.3 в течение 3 сут. При этом плотность (численность) клеток водорослей в подготовленной к тестированию культуре должна находиться в пределах от 2,0·10 до 2,5·10 клеток/см.
     

     ДА.1.4 Непосредственно перед тестированием в подготовленной по ДА.1.3 трехсуточной культуре водорослей определяют в соответствии с требованиями ДВ.1 (приложение ДВ) плотность (численность) клеток в 1 см суспензии водорослей, используя для этого не менее двух аликвот суспензии. Полученное значение плотности (численности) клеток водорослей должно находиться в пределах от 2·10 до 2,5·10 клеток/см. Если полученное значение менее 2,0·10 клеток/см, то увеличивают продолжительность культивирования водорослей (см. ДА.1.3) еще на сутки. Затем рассчитывают необходимый объем суспензии для внесения в каждую колбу с контрольной и анализируемой пробой при тестировании.
     
      Примечание - Чтобы получить в начале тестирования плотность (численность) клеток водорослей в пределах от 2·10 до 2,5·10 клеток/см, достаточно в каждую емкость внести 1,0 см суспензии водорослей из культуры, плотность (численность) которой находится в пределах от 2·10 до 2,5·10 клеток/см.
     

ДА.2 Культивирование водорослей для метода Б

ДА.2.1 Культивирование водорослей проводят в конических колбах вместимостью 250 см на питательной среде [см. А.2.2 (приложение А)] в условиях тестирования по 6.4.1.

ДА.2.2 Необходим регулярный пересев культур водорослей, для Sceletonema costatum (Greville) Cleve его осуществляют один раз в 7 сут; для Phaeodactylum tricomutum Bohlin - один раз в 14 или 21 сут. При этом пересев культур водорослей проводят аналогично ДА.1.2 в условиях по 6.4.1 с использованием питательной среды по А.2.2 (приложение А).

ДА.2.3 Для тестирования культуру водорослей готовят следующим способом: в питательную среду [см. А.2.2 (приложение А)] добавляют такой объем суспензии водорослей из маточной культуры водорослей (см. ДА.2.2), чтобы получить начальную плотность (численность) клеток, соответствующую диапазону от 2,0·10 до 10 клеток/см, и выдерживают в условиях тестирования по 6.4.1 в течение 3 сут.

ДА.2.4 Культура водорослей, подготовленная по ДА.2.3, в течение тестирования должна обеспечить экспоненциальный рост водорослей. Непосредственно перед тестированием определяют плотность (численность) клеток в подготовленной культуре водорослей в соответствии с требованиями ДВ.1 (приложение ДВ) и рассчитывают необходимый объем суспензии водорослей для внесения в каждую колбу с контрольной и анализируемой пробой для тестирования.

ДА.3 Адаптация водорослей к воде различной минерализации (солености)

ДА.3.1 Природная морская вода в разных морях и отдельных акваториях моря имеет различную минерализацию (соленость), поэтому необходимо иметь культуру водорослей, заранее адаптированную к разной минерализации (солености) анализируемой пробы воды (водной вытяжки), подлежащей тестированию, и содержать ее в заданных условиях для культивирования.

Если минерализация (соленость) морской воды (см. 5.2), на которой готовили питательную среду для культуры водорослей, выше, чем минерализация (соленость) анализируемой пробы, то морскую воду разбавляют дистиллированной водой до минерализации (солености) анализируемой пробы и используют ее для приготовления новой питательной среды.
     

    ДА.3.2 Адаптацию водорослей к среде необходимой минерализации (солености) проводят, меняя постепенно минерализацию (соленость) питательной среды. Для этого в стерильную колбу вместимостью 250 см над пламенем спиртовки вносят 80 см суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (в возрасте 3 сут) и добавляют 20 см питательной среды необходимой минерализации (солености). Культивируют водоросли в условиях, аналогичных тестированию анализируемых и контрольных проб: для метода А - по 5.4.3.3; для метода Б - по 6.4.1. При этом общий объем адаптируемой культуры водорослей должен составлять 100 см.
      
     Через каждые 5 сут меняют соотношение адаптируемой культуры и питательной среды необходимой минерализации (солености) следующим способом: 60 см адаптируемой культуры и 40 см питательной среды; 40 см адаптируемой культуры и 60 см питательной среды; 20 см адаптируемой культуры и 80 см питательной среды.
     
     При адаптации каждый раз культуру водорослей пересевают в новую стерильную колбу со свежеприготовленной питательной средой той минерализации (солености), к которой проводят адаптацию. Через 20 сут адаптацию заканчивают.
     

ДА.3.3 Адаптированную культуру водорослей пересевают на свежеприготовленную питательную среду и культивируют в течение 5 сут в условиях по 5.4.3.3 - для метода А, по 6.4.1 - для метода Б, после чего проверяют физиологическую чувствительность адаптированной культуры водорослей в соответствии с требованиями 5.3.4.