ГОСТ 9.052-88 Единая система защиты от коррозии и старения (ЕСЗКС). Масла и смазки. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов

ПРИЛОЖЕНИЕ
Обязательное

     
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ГРИБОСТОЙКОСТИ

Сущность метода заключается в определении количества внутриклеточной аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) в минеральной среде после испытания масел на грибостойкость (п.3.6.5) с помощью специфической ферментативной хемилюминесцентной реакции с использованием люциферин-люциферазной системы светляков. Интенсивность излучаемого свечения прямо пропорциональна концентрации АТФ. Концентрация АТФ пропорциональна количеству живых клеток, так как ее содержание во всех типах живых клеток примерно одинаково и составляет 1-10 мг/г сухого веса. Этот факт является основной биолюминесцентного метода определения биомассы.

    1. Аппаратура, материалы и реактивы

Хемилюминометр медицинский ДЛИ 31.560.000, предназначенный для измерения интенсивности сверхслабого свечения в области спектра 400-600 нм. Допускается использовать другие приборы аналогичного назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 10 до 10 квант/с.

Весы для статического взвешивания по ГОСТ 29329.

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200°С.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317.

Дозатор для отбора проб 0,1 см.

Лабораторный рН-метр.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.

Колбы цилиндрические мензурные вместимостью 25 см по ГОСТ 1770.

Пипетки вместимостью 1, 10 см.

Аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевая соль, 3-водная (АТФ).

Люцифераза светляков.

Люциферин.

Диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч.

Трис-(оксиметил)-аминометан, х.ч.

Кислота уксусная, х.ч. по ГОСТ 61.

Магний сернокислый, 7-водный, х.ч. по ГОСТ 4523.

Соль динатриевая этилендиамин - N, N, N', N' - тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) (ЭДТА) по ГОСТ 10652.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

2. Подготовка к испытаниям

2.1. Стерилизуют посуду по ГОСТ 9.048.

2.2. Готовят раствор АТФ 1 ммоль/дм: 13,8 мг АТФ помещают в мерную колбу вместимостью 25 см, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Раствор АТФ 1 ммоль/дм разливают на порции объемом 1 см и хранят при температуре минус 20°С. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более 3 месяцев.

2.3. Готовят стандартный раствор АТФ 10 мкмоль/дм: порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм (по п.2.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см дистиллированной воды. Раствор АТФ 10 мкмоль/дм готовят непосредственно перед применением.

2.4. Готовят 20%-ный раствор уксусной кислоты: 10 см уксусной кислоты разбавляют 40 см дистиллированной воды.

2.5. Готовят 0,1 моль/дм трис-ацетатный буферный раствор с рН-7,6, содержащий 10 ммоль/дм сернокислого магния, 2 ммоль/дм ЭДТА: в мерную колбу вместимостью 50 см загружают 0,605 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,123 г сернокислого магния, 0,036 г ЭДТА, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Затем все содержимое колбы переносят в стакан вместимостью 100 см и титруют 20%-ным раствором уксусной кислоты до рН-7,8.

2.6. Готовят раствор люциферазы: 10 мг люциферазы растворяют в 10 см 0,1 моль/дм трис-ацетатном буферном растворе (п.2.5). Приготовленный раствор люциферазы хранят во льду.