ГОСТ 34554-2019 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Испытания по оценке репродуктивной токсичности двух поколений (с Поправкой)

     6 Наблюдения

6.1 Клинические наблюдения

Общее клиническое наблюдение за животными проводят каждый день, при использовании желудочного зонда и при выборе времени проведения процедуры должен учитываться ожидаемый пиковый период эффекта после введения исследуемого вещества. Следует регистрировать изменения поведенческих реакций, признаки тяжелых или затяжных родов и все проявления токсических эффектов. Дополнительно более детальный осмотр каждого животного следует проводить не реже одного раза в неделю и его удобно совмещать с процедурой взвешивания. Дважды в день в рабочие дни и один раз в день в выходные дни, если возможно, все животные должны быть проверены на наличие заболеваний или гибель.

Животных, обнаруженных в предсмертном состоянии и/или демонстрирующих сильные боли и признаки тяжелых мучений (в том числе не способных потреблять корм и воду), с резким снижением массы тела (более 10% в сутки), следует умерщвлять гуманным способом.

6.2 Масса тела и потребление корма/воды животными, приносящими потомство

Животных, приносящих потомство (поколения Р и F1), следует взвешивать в первый день начала введения исследуемого вещества и не менее одного раза в неделю в течение всего исследования. Самок этих поколений животных следует взвешивать как минимум в следующие дни беременности - 7, 14 и 20 или 21, а также в течение периода лактации одновременно со взвешиванием потомства и в день эвтаназии. Данные наблюдений следует регистрировать индивидуально для каждого взрослого животного. Во время спаривания и беременности измеряют потребление корма не менее одного раза в неделю. Потребление воды измеряют не менее одного раза в неделю, если исследуемое вещество вводят вместе с водой.

При введении исследуемого вещества с кормом или водой следует отслеживать их потребление ежедневно. При других способах введения во время спаривания и в период беременности потребление корма и воды измеряют не реже одного раза в неделю.

6.3 Овариальный цикл

Длительность и нормальность овариального цикла оценивают у самок поколений Р и F1 по вагинальному мазку до начала спаривания, и при необходимости, во время спаривания, до получения признаков спаривания. При получении образцов клеток вагины/шейки матки необходимо соблюдать осторожность для предотвращения повреждения слизистой и, как следствие, вызывания ложной беременности [2].

6.4 Характеристики спермы

6.4.1 У всех самцов поколений Р и F1 после эвтаназии должна быть зарегистрирована масса яичек и эпидидимиса, один из органов сохраняют для гистопатологического исследования (см. 6.7.1, 7.1.1, 7.1.3). Из подгруппы числом не менее 10 мужских особей от каждой опытной группы самцов поколений Р и F1 оставшиеся яички и придатки яичек (эпидидимис) должны быть использованы для подсчета устойчивых к гомогенизации сперматидов и резервов спермы хвоста придатка яичка соответственно. У этого количества самцов должна быть отобрана сперма из хвоста придатка яичка или семявыводящего канала для оценки подвижности и морфологии сперматозоидов. Если обнаружены токсические эффекты исследуемого вещества или имеются данные других исследований о его возможном влиянии на сперматогенез, то оценка сперматозоидов должна быть проведена у всех самцов во всех подопытных группах; в других случаях количественные оценки могут быть проведены только у самцов поколений Р и F1 контрольной группы и группы, получившей самую высокую дозу.

6.4.2 Должно быть вычислено общее количество устойчивых к гомогенизации сперматидов яичек и сперматозоидов хвоста придатка яичка [3], [4]. Резервы сперматозоидов хвоста придатка яичка могут быть определены по концентрации и объему сперматозоидов в суспензии, использованной для качественных оценок, и количеству сперматозоидов, полученных при последующем измельчении и/или гомогенизации оставшейся ткани хвоста придатка. Количественный подсчет следует проводить на отобранной подгруппе животных из всех опытных групп непосредственно после эвтаназии животных, если не проводится видео- или цифровая запись или если образцы не подвергаются заморозке для последующего анализа. В этих случаях в первую очередь могут быть изучены образцы от животных из контрольной группы и группы, получавшей наивысшую дозу исследуемого вещества. Если не обнаружено связанных с веществом воздействий на сперму (например, влияние на количество сперматозоидов, их подвижность или морфологию), то исследование образцов тканей животных других групп проводить не обязательно. Если выявлены воздействия у животных, получавших максимальную дозу, то животные с более низкими дозами также должны быть изучены.

6.4.3 Подвижность сперматозоидов придатка яичка (или спермовыводящего канала) следует оценивать или фиксировать на видео непосредственно после эвтаназии. Процедура получения сперматозоидов должна обеспечивать их минимальное повреждение, для анализа подвижности ее разбавляют с помощью приемлемых методов [5]. Процент прогрессивно-подвижных сперматозоидов следует определять субъективно или объективно. При проведении анализа движения компьютеризированными методами [6]-[11] определение прогрессивной подвижности основано на определяемой оператором норме для средней скорости пробега и индекса линейности или прямого движения.

Если во время вскрытия образцы снимают на видео [12] или регистрируют изображение другими методами, далее может быть проведен анализ тканей самцов поколений Р и F1 только контрольной группы и группы с максимальной дозой, если токсическое влияние исследуемого вещества не обнаружено; в противном случае также должны быть исследованы образцы из групп с более низкой дозой. При отсутствии видеозаписи или цифрового изображения все образцы из всех опытных групп должны быть исследованы при вскрытии.

6.4.4 Должно быть проведено морфологическое исследование образцов сперматозоидов придатка яичка (или семявыводящего протока). Сперматозоиды (не менее 200 на образец) должны быть исследованы в виде фиксированных влажных препаратов [13] и оценены как нормальные или с наличием патологий. Примеры морфологических патологий спермы могут включать слияние, отдельные головки, деформированные головки и/или хвосты. Исследование следует проводить на отобранной подгруппе животных из всех опытных групп непосредственно после эвтаназии животных, если не проводится видео- или цифровая запись, которая может быть проанализирована впоследствии. Мазки после их фиксации также могут быть изучены позже. В этих случаях первыми могут быть проанализированы образцы от животных из контрольной группы и группы, получавшей максимальную дозу исследуемого вещества. Если не обнаружены воздействия, обусловленные веществом (например, влияние на морфологию сперматозоидов), то исследование образцов тканей животных с другими дозовыми группами проводить не обязательно. Если эффекты, связанные с исследуемым веществом, выявлены у животных, получавших максимальную дозу, то животные с более низкими дозами также должны быть изучены.

6.4.5 Если любой из вышеописанных параметров оценки сперматозоидов уже был изучен в рамках исследования системного токсического действия продолжительностью не менее 90 дней, то повторения этих исследований в данном эксперименте не требуется. Однако рекомендуется провести видео- или цифровую регистрацию изображения образцов сперматозоидов животных поколения Р для обеспечения при необходимости последующей оценки.

6.5 Потомство

6.5.1 Каждый помет после родов (день лактации - нулевой) должен быть исследован по возможности быстро для установления количества и пола животных, мертворожденных и живорожденных и наличия врожденных аномалий. Потомство, обнаруженное мертвым в нулевой день периода лактации, при отсутствии признаков мацерации, по возможности должно быть осмотрено на наличие возможных дефектов развития и причин смерти и законсервировано. Живое потомство должно быть подсчитано и индивидуально взвешено при рождении (день лактации - нулевой) или на следующий день (1-й день), а также должно регулярно взвешиваться в определенные дни, например в 4, 7, 14 и 21-й дни лактации. Должны регистрироваться физические отклонения или изменения поведения, наблюдаемые у самок и потомства.

6.5.2 Физическое развитие потомства должно оцениваться, как правило, по увеличению массы тела. Другие физические параметры (например, открытие ушей и глаз, прорезывание зубов, рост шерсти) могут представлять дополнительную информацию, но эти данные, как правило, оцениваются в отношении данных о половом созревании (возраст и масса тела при открытии вагины или отделение крайней плоти от головки пениса) [14]. Функциональные параметры (моторная функция, сенсорная функция, развитие рефлексов) рекомендуется оценивать у детенышей поколения F1 до и/или после прекращения грудного вскармливания (в одном возрасте для всех групп, в зависимости от проявлений токсического действия исследуемого вещества), особенно функции, связанные с половым созреванием, если такие анализы не включены в отдельные токсикологические исследования. Возраст открытия вагины и отделения крайней плоти должен быть установлен для животных поколения F1, выбранных для спаривания. У новорожденных поколения F2 в день родов должно быть измерено аногенитальное расстояние, если в поколении F1 произошло изменение отношения полов или длительности полового созревания.

6.5.3 Определение функциональных характеристик животных можно не проводить, если в группе наблюдаются выраженные токсические эффекты (например, значительное отставание в прибавке массы тела и др.). Функциональное обследование не проводят на потомстве, выбранном для спаривания.

6.6 Общее патологическое обследование

6.6.1 На момент эвтаназии или гибели в ходе исследования все взрослые животные (поколений Р и F1), все потомство с внешними дефектами развития или клиническими проявлениями, а также не менее одного случайно выбранного животного - потомство/пол/помет из обоих поколений F1 и F2, должны быть подвергнуты общему патологическому макроскопическому исследованию на наличие структурных нарушений или патологических изменений. Особое внимание следует обращать на органы репродуктивной системы. Потомки, подвергнутые эвтаназии и погибшие, при отсутствии мацерации, должны быть исследованы на наличие возможных дефектов и/или причин смерти и законсервированы.

6.6.2 Должны быть исследованы матки всех впервые рожающих самок с использованием процедуры, предупреждающей негативное влияние на последующее гистологическое исследование, на наличие и количество мест имплантации.

6.7 Взвешивание органов

6.7.1 На момент эвтаназии должна быть определена масса тела и масса нижеприведенных органов всех родительских животных поколений Р и F1 (парные органы взвешиваются индивидуально):

- матка, яичники;

- яички, придаток яичка (тело и хвост);

- предстательная железа;

- семенные пузырьки с коагулирующими железами и их жидкость (как одно целое);