ГОСТ 34554-2019 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Испытания по оценке репродуктивной токсичности двух поколений (с Поправкой)

     4 Процедура исследования

4.1 Число и пол животных

Каждая подопытная и контрольная группы должны содержать число животных, достаточное для получения не менее 20 беременных самок, достигших родов. При испытании веществ, вызывающих нежелательные эффекты (например, стерилизация, повышенная токсичность при высокой дозе) это может быть недостижимо. Основная задача - получить достаточное количество беременных животных для обеспечения объективной оценки возможного влияния вещества на репродуктивную функцию, беременность, материнское поведение и вскармливание, рост и развитие поколения F1 от зачатия до полового созревания и развитие их потомства (поколения F2) до окончания грудного вскармливания. В случае невозможности получения желаемого числа беременных самок (т.е. не менее 20) не обязательно прекращать исследование, и каждый конкретный случай должен оцениваться отдельно.

4.2 Подготовка вещества для введения

4.2.1 Исследуемое вещество вводится перорально (с пищей, питьевой водой или через желудочный зонд). При необходимости допустимы другие пути введения вещества (например, через кожу или ингаляционно). Пероральный путь введения вещества является предпочтительным.

4.2.2 При необходимости исследуемое вещество растворяют или суспендируют в подходящем растворителе (носителе). Рекомендуется по возможности сначала использовать водные растворы/суспензии, далее рассматривают возможность использования масляных растворов/эмульсий (например, с кукурузным маслом), а затем возможность приготовления раствора с использованием других растворителей. Для растворителей, отличных от воды, должны быть известны токсичные характеристики носителя. Должна быть подтверждена стабильность исследуемого вещества в растворителе.

4.3 Выбор дозы

4.3.1 В план исследования должны быть включены не менее трех уровней доз с параллельным контролем. При отсутствии ограничения по физико-химическому или биологическому воздействию исследуемого вещества следует выбирать максимальный уровень дозы для достижения токсического воздействия, который не должен быть летальным и не вызывать тяжелых страданий. При неожиданной гибели животных допустимыми считают исследования с уровнем смертности первого поколения Р не более 10%. Следует выбрать нисходящую последовательность уровней дозы с целью обнаружения любого эффекта, связанного с дозировкой, и уровня без наблюдаемых токсических эффектов (NOAEL) или дозы, близкие к пределу обнаружения, которые позволяют определить ориентировочную дозу. Обычно оптимальным считается 2-4-кратный интервал для установки уровней нисходящей дозы, и дополнительно для 4-й подопытной группы рекомендуется использовать больший интервал (например, более чем десятикратное уменьшение) между дозами. Для исследований, в которых вещество смешивают с кормом, интервал между дозами не должен превышать трехкратную дозу. Уровень доз следует выбирать с учетом имеющихся токсикологических данных, в частности, результатов исследований с многократным введением вещества. Должна быть учтена любая имеющаяся информация о метаболизме и кинетике исследуемого вещества или родственных веществ. Кроме того, такая информация также будет полезна для демонстрации адекватности выбранного режима введения доз.

4.3.2 Контрольная группа должна состоять из животных, не получающих исследуемое вещество или получающих только растворитель, если растворитель используют для введения исследуемого вещества. За исключением введения исследуемого вещества, животные контрольной группы должны подвергаться всем тем же процедурам, что и животные подопытных групп. При использовании растворителя контрольная группа должна получать растворитель в максимально используемом объеме. Если исследуемое вещество вводится вместе с кормом и вызывает снижение потребления или использования корма, то может потребоваться использование спаренной контрольной группы. Могут быть использованы альтернативные данные из контролируемых исследований, проведенных для оценки влияния снижения потребления пищи на параметры репродуктивности, вместо соответствующей спаренной контрольной группы, получающей одинаковое питание.

4.3.3 Должны быть учтены следующие свойства растворителя и других добавок: влияние на абсорбцию, распределение, метаболизм или сохранение исследуемого вещества; влияние на химические свойства исследуемого вещества, приводящее к изменению его токсикологических характеристик; влияние на потребление пищи или воды или состояние упитанности животных.

4.4 Испытание на предельную дозу

Если введение в желудок одной суточной дозы, эквивалентной не менее 1000 мг/кг массы тела, с кормом или питьевой водой, с использованием процедур настоящего исследования, не вызывает наблюдаемых токсических эффектов и на основании данных о структурно и/или метаболически родственных соединениях токсичность не предполагается, то полное исследование с использованием нескольких уровней дозы может не считаться необходимым. Испытание на предельную дозу применяют, кроме случаев, когда воздействие на человека показывает необходимость использования более высокой дозы при внутрижелудочном введении. При использовании других способов введения, таких как ингаляция или нанесение на кожу, предельная доза часто зависит от физико-химических свойств исследуемого вещества, например растворимости.

4.5 Введение доз

4.5.1 Животные должны получать исследуемое вещество в течение семи дней в неделю. Предпочтительным является введение в желудок (с кормом, питьевой водой или желудочным зондом). Использование другого способа введения должно быть обосновано, и могут потребоваться соответствующие изменения.

Все животные должны получать вещество одинаковым способом в течение соответствующего периода проведения эксперимента. При введении исследуемого вещества через желудочный зонд следует использовать соответствующий желудочный катетер. Объем жидкости, вводимой за один раз, не должен превышать 1 мл/100 г массы тела животного (для кукурузного масла максимальный объем - 0,4 мл/100 г массы тела), за исключением водных растворов, которые могут вводиться в объеме 2 мл/100 г массы тела. Для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз вариабельность вводимого объема должна быть сведена к минимуму путем корректировки концентраций, за исключением раздражающих или разъедающих веществ, у которых, как правило, наблюдаются выраженные токсические эффекты при повышенных концентрациях. При использовании желудочного зонда потомство обычно получает исследуемое вещество опосредованно через молоко до момента прямого введения после прекращения грудного вскармливания. При введении вещества с кормом или водой потомство, как правило, будет дополнительно получать исследуемое вещество, когда они начнут кормиться самостоятельно в последнюю неделю периода лактации.

Допускается при введении исследуемых веществ с помощью желудочного зонда ограничить животных в пище и воде (крыс не кормить с вечера и не поить за три-четыре часа перед введением). После голодания необходимо взвесить животных, затем ввести исследуемое вещество. После введения препарата крыс не кормить и не поить три-четыре часа. Если дозу вводят порционно, в зависимости от времени ее введения животным может потребоваться корм или вода.

4.5.2 При введении веществ с кормом или питьевой водой важно обеспечить отсутствие влияния количества исследуемого вещества на нормальное питание или водный баланс у животных. При введении вещества с кормом используют постоянную концентрацию вещества в корме (ppm) или постоянное соотношение уровня дозы с массой тела животных; использование альтернативных способов должно быть зафиксировано. При введении исследуемого вещества через желудочный зонд дозу следует вводить каждый день в одно время и еженедельно корректировать для обеспечения постоянного соотношения уровня дозы и массы тела животного. При расчете дозы, вводимой через зонд, по отношению к массе тела животного, необходимо учитывать информацию о плацентарном распределении.

4.6 Графики эксперимента

4.6.1 Ежедневное введение исследуемого вещества самкам и самцам первого поколения лабораторных животных Р начинают в возрасте от пяти до девяти недель. Ежедневное введение самкам и самцам поколения F1 начинают после прекращения грудного вскармливания; следует помнить, что в случае введения вещества с пищей или питьевой водой прямое воздействие на потомство поколения F1 уже происходило на протяжении периода лактации. Для животных обоих полов (поколений Р и F1) введение исследуемого вещества следует проводить на протяжении не менее 10 недель до начала периода спаривания. Затем введение самцам и самкам продолжают на протяжении двухнедельного периода спаривания. После этого, если самцы больше не требуются для оценки действия исследуемого вещества на репродуктивную систему, они подвергаются эвтаназии гуманным способом и патологическому исследованию. Самкам поколения Р вещество продолжают вводить на протяжении периода беременности и до окончания грудного вскармливания потомства поколения F1. Следует рассмотреть необходимость внесения изменения в график дозирования на основе имеющейся информации об исследуемом веществе, включая имеющиеся токсикологические данные, данные о метаболизме или биоаккумуляции вещества. Доза, вводимая каждому животному, как правило, основана на самом последнем определении массы тела животного. Однако следует соблюдать осторожность при корректировке дозы в течение последнего триместра беременности.

4.6.2 Введение вещества животным поколений Р и F1 должно продолжаться до прекращения исследования. Все животные этих поколений должны быть умерщвлены гуманным способом после прекращения периода наблюдения за влиянием исследуемого вещества на репродуктивную функцию. Животные поколения F1, не отобранные для спаривания, и все животные поколения F2 должны быть умерщвлены гуманным способом после окончания периода грудного вскармливания.