ГОСТ ISO/TS 13136-2016 Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп O157, O111, O26, O103 и O145 (с Поправкой)
Приложение F
(обязательное)
Выделение чистых штаммов STEC
Данную методику используют для выделения чистых штаммов STEC из проб, положительно прореагировавших на ПЦР в режиме реального времени.
a) В случае положительного результата о присутствии одного из генов, связанных с серогруппами рассматриваемых в рамках настоящего стандарта, проводится процедура обогащения, для облегчения выделения STEC (см. примечание 1).
b) Обогащение проводится на культуральных средах для обогащения SSE или на ТВХ или другой подходящей среде (см. примечание 2). Инкубируют в течение 18 ч до 24 ч при температуре (37±1)°С.
c) 50 колоний Е. coli с характерной морфологией или с характерными признаками (см. примечание 5) снимают с питательного агара (NA) (см. примечание 3) и переносят в пробирки с водой (колонии могут быть объединены в воде в общей сложности по 10).
d) Проводят детекцию на наличие stx-кодирующих генов в изолированных колониях, перенесенных в воду (см. примечание 4).
e) Если проба будет положительной, высевают клетки на питательный агар для анализа отдельных колоний, чтобы выделить одну положительную колонию.
f) Идентифицируют колонии, как Е. coli, и подтверждают наличие еае-гена и принадлежность к серогруппе (например, с помощью ПЦР в режиме реального времени (см. приложении F, а также примечание 5).
g) Изоляты ДНК могут быть отправлены в референс-лабораторию для дальнейшего подтверждения.
Примечание 1 - Обогащение конкретных серогрупп можно провести с помощью иммунологических систем, таких как IMS или ее эквивалентов, при этом, как правило, следуют инструкциям производителя.
Примечание 2 - Для подтверждения принадлежности проб к О157 серогруппе применяют [19] или альтернативные методы, валидированые в соответствии с [18]. Принадлежность к сорбитол-ферментирующим Е. coli серогруппы О157 определяют наличием теллурита, используя селективную среду СТ SMAC согласно [19]. Поэтому является целесообразным использование дублирующей чашки Петри с SMAC без антибиотиков.
Для выделения STEC, принадлежащих к серогруппе О26, используют селективную плотную питательную среду (МакКонки), которая содержит рамнозу вместо лактозы (RMAC). Это очень эффективный способ выявления штаммов STEC серогруппы О26, которые не ферментируют рамнозу в отличие от других видов Е. coli.
Примечание 3 - Существует несколько типов питательных сред на основе агара, либо в виде готовых к использованию чашек или для приготовления в лаборатории из сухих порошков. Каждый тип неселективной питательной агаровой среды (например, TSA) подходит для целей выращивания колонии для дальнейшей дифференциации. Также можно использовать энтерогемолизический агар. Это имеет преимущество, так как способность продуцировать энтерагемолезин является общим признаком STEC патогенных для человека.
Примечание 4 - ПЦР в режиме реального времени, описанная в данном стандарте может быть использована для подтверждения наличия генов stx и еае в геноме клеток выделенных штаммов. Стандартная ПЦР может быть использована в качестве альтернативы (см. приложение В).
Примечание 5 - Подтверждение принадлежности колоний к Е. coli можно провести при использовании любого коммерческого биохимического анализа, либо по способности клеток выделять индол. Дифференциация по серогруппам может быть проведена либо с помощью ПЦР, либо с помощью реакции агглютинации с использованием коммерческой антисыворотки.