ГОСТ ISO/TS 13136-2016 Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп O157, O111, O26, O103 и O145 (с Поправкой)

     9 Методика проведения испытания

9.1 Приготовление анализируемой пробы и исходной суспензии

9.1.1 Общие положения

Используют количество среды для обогащения, необходимое для получения окончательного разведения 10 первоначальной анализируемой пробы.

9.1.2 Приготовление анализируемых проб с предположительно высоким уровнем фоновой микрофлоры

В случае твердых проб пищевой продукции порцию анализируемой пробы (х г) в стерильных условиях переносят в мешок перистальтического смесителя, содержащий 9х см бульона mTSB, в который добавлен новобиоцин или акрифлавин (см. 5.1.1.4). Рекомендуется использовать мешки, оснащенные фильтрами.

Полученную смесь гомогенизируют в смесителе (см. 6.8; см. ISO 7218).

В случае жидких проб пищевой продукции порцию анализируемой пробы (х см) в стерильных условиях переносят в мешок перистальтического смесителя, содержащий 9х см бульона mTSB для обогащения, в который добавлен новобиоцин или акрифлавин (см. 5.1.1.4).

9.1.3 Приготовление анализируемых проб, предположительно содержащих целевые бактерии, подвергнутые стрессу

Замороженные пробы размораживают при комнатной температуре, затем порцию анализируемой пробы (х г или х см) переносят в мешок перистальтического смесителя или пробирку, содержащую 9х см BPW (см. 5.1.2) и далее действуют, как это описано выше.

9.2 Обогащение

9.2.1 Инкубирование

Содержимое мешка перистальтического смесителя, пробирки или флакона (см. 9.1.2) инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 18-24 ч.

9.2.2 Контроль над процессом (для ПЦР в реальном времени)

Контроль над процессом выполняют в соответствии с положениями, изложенными в ISO 22174.

Руководство по внутреннему контролю амплификации (IAC) и контролю над процессом приведены в приложении D и С.3.8.

9.3 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)

Методики экстракции нуклеиновых кислот (ДНК) должны соответствовать методикам, применяемым в отношении грамотрицательных бактерий. Полный перечень методов приведен в [10]. Кроме того, допускается использовать имеющиеся в продаже наборы в соответствии с инструкциями изготовителя.

9.4 ПЦР-амплификация (для ПЦР в режиме реального времени)

9.4.1 Общие положения

Используемый процесс ПЦР-амплификации применяют при проведении ПЦР в режиме реального времени.

Необходимо выполнять все требования к ПЦР-амплификации, которые изложены в ISO 20838.

Информация о праймерах и зондах для обнаружения, использующихся при проведении ПЦР в режиме реального времени, приведена в приложении Е.

9.4.2 Обнаружение продуктов ПЦР

Прибор для обнаружения продуктов ПЦР улавливает световое излучение, как только оно возникает в процессе амплификации.

9.4.3 Интерпретация результатов ПЦР-анализа

Результаты, полученные при проведении ПЦР, в том числе контрольные, информация о которых приведена в ISO 22174 и в приложении D, обрабатывается программным обеспечением прибора для амплификации. В ходе процесса амплификации программное обеспечение прибора контролирует ПЦР-амплификацию с использованием 5'-нуклеазы посредством анализа интенсивности флуоресценции репортерного красителя для каждой пробы, - это разность и контрольного значения интенсивности флуоресценции репортерного красителя, определенного в результате первых нескольких циклов. Значение порогового цикла, , определяют как номер цикла, при котором значение интенсивности флуоресценции данной пробы превышает установленное значение порогового цикла.

В случае, если были получены сомнительные результаты, проводят проверку кривых значений излучения на графике. Для проб, демонстрирующих положительный результат, характерна кривая, на которой явно выражено усиление флуоресценции, начиная с количества циклов, значения которых соответствуют .

Если полученные значения приводят к непредвиденным результатам, то анализ повторяют.