ГОСТ ISO/TS 13136-2016 Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп O157, O111, O26, O103 и O145 (с Поправкой)

     4 Сущность метода

4.1 Общие положения

Используемый метод состоит из следующих последовательных этапов:

a) микробное обогащение;

b) выделение нуклеиновых кислот (ДНК);

c) выявление генов вирулентности;

d) выявление генов, присутствующих в серогруппах;

e) селекция из положительных проб.

Примечание - Блок-схема проведения исследования представлена на рисунке А.1.

4.2 Микробное обогащение

Бактерии STEC выявляют после увеличения их количества путем инкубирования анализируемой пробы в неселективной жидкой питательной среде, например:

a) модифицированный триптон-соевый бульон (триптон-соевый бульон с добавлением соли желчных кислот N 3, концентрация которой - 1,5 г/дм, и добавлением новобиоцина, концентрация которого - 16 мг/дм) - mTSB+N;

b) забуференная пептонная вода (BPW);

c) модифицированный триптон-соевый бульон (триптон-соевый бульон с добавлением соли желчных кислот N 3, концентрация которой - 1,5 г/дм, и добавлением акрифлавина, концентрация которого - 12 мг/дм) - mTSB+A, для анализа молока и молочных продуктов.

mTSB используют при анализе проб, предположительно содержащих большие количества нецелевых микроорганизмов.

Новобиоцин и акрифлавин подавляют рост грамположительных бактерий и способствуют росту грамотрицательных бактерий, в том числе STEC.

BPW применяют для анализа проб, которые предположительно содержат подвергнутые стрессу целевые бактерии (например, пробы замороженных продуктов), чтобы реанимировать подвергнутые стрессу бактерии STEC, и предположительно содержащие меньшее количество нецелевых микроорганизмов, чем свежие пробы.

Примечание - Добавление новобиоцина является спорным и было исследовано несколькими авторами. Было установлено, что минимальная ингибирующая концентрация антибиотика для бактерий STEC, не относящихся к серогруппе О157, ниже, чем для штаммов серогруппы О157 (см. [5]). Добавление новобиоцина при обогащении в mTSB, когда концентрация новобиоцина является типичной (20 мг/дм), как это установлено в [19], приводило к подавлению роста приблизительно одной трети клеток штаммов бактерий, не относящихся к серогруппе О157 (см. [6]), что повышает риск ложно-отрицательных результатов.

4.3 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)

Нуклеиновые кислоты экстрагируют в соответствии с требованиями используемой системой ПЦР в режиме реального времени.

4.4 Выявление целевых генов

Очищенную ДНК используют для обнаружения следующих целевых генов:

- основные гены вирулентности для STEC: генов stx, кодирующих токсины Шига и еае-гена, кодирующего белок массой 90 кда - интимин, участвующих в механизме адгезии, которая является характерным признаком штаммов STEC, вызывающих тяжелые заболевания. Гены stx кодируют семейство токсинов, в том числе два основных типа: stx1 и stx2. Stx2 состоит из семи четко установленных вариантов - от stx2a до stx2g (см. [22]). Варианты генов stx2a, stx2b и stx2c, присутствующие в штаммах бактерий STEC, в числе генов, которые приведены в разделе 1, представляют собой целевые гены, кодирующие Шига-токсин, на которые распространяется настоящий стандарт.

В базе данных GenBank генам, кодирующим данные варианты stx2, присвоены следующие обозначения: stx2a: Х07865; stx2b: L11078; stx2c: М59432.

- ген еае, кодирующий интимин;

- гены для определения соответствующей серогруппы: rflbE(O157), wbdl(O111), wzx(O26), ihp1(O145) и wzx(O103).

4.5 Выявление

Выявление целевых генов проводят в соответствии с требованиями используемой системы ПЦР в режиме реального времени.

4.6 Селекция из положительных проб