ГОСТ Р 55448-2013 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания охратоксина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием
8 Проведение испытаний
8.1 Экстракция охратоксина А из пробы
(5,00±0,01) г измельченной анализируемой пробы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см. Добавляют 30 см
хлороформа и 2,5 см
раствора уксусной кислоты (см. 7.4.3), интенсивно перемешивают 30 мин. Пропускают полученный экстракт через бумажный складчатый фильтр "красная лента", отбирая 20 см
фильтрата для упаривания.
Если не удается отобрать 20 см фильтрата, то отбирают максимально возможный объем, измеряют его и используют полученное значение в формуле (6).
Переносят полученный фильтрат в остродонную колбу вместимостью 50 см и упаривают досуха в вакууме при температуре водяной бани 40 °С - 45 °С.
8.2 Очистка фильтрата
Сухой остаток, полученный по 8.1, растворяют в 1 см хлороформа, получая таким образом концентрат анализируемой пробы.
Подготавливают стеклянную колонку по 7.8. Дают хлороформу стечь до уровня сульфата натрия и наносят на колонку концентрат анализируемой пробы. Остродонную колбу из-под фильтрата ополаскивают 2 раза по 1 см хлороформа, который также наносят на колонку. После этого промывают колонку 10 см
гексана, элюат отбрасывают.
Далее через колонку пропускают 30 см смеси хлороформа с муравьиной кислотой (см. 7.4.4), элюируя охратоксин А со скоростью прокапывания не более чем одна капля в секунду. Весь элюат собирают в остродонную колбу и упаривают досуха в вакууме при температуре водяной бани 40 °С - 45 °С.
Сухой остаток растворяют в 0,5 см подвижной фазы (см. 7.4.2) и перемешивают 1 мин. Затем добавляют 3 см
гексана и снова интенсивно перемешивают. После расслоения двух несмешивающихся между собой фаз аккуратно, при помощи градуированной пипетки вместимостью 1 см
или одноканального пипеточного дозатора, переносят приблизительно 0,3 см
нижнего слоя в пробирку для микропроб однократного применения вместимостью 1,5 см
(пробирка Эппендорфа). Полученный концентрат используют для хроматографических измерений по 8.3 в день проведения испытаний.
8.3 Проведение хроматографических измерений
Регистрируют не менее двух хроматограмм концентрата анализируемой пробы, полученного по 8.2, в тех же условиях, при которых была проведена градуировка системы. Идентификацию охратоксина А проводят по совпадению времени удерживания охратоксина А в экстракте пробы с его временем удерживания, полученном при контроле стабильности градуировочной характеристики, установив ширину окна идентификации 5%.
Пример хроматограммы приведен на рисунке А.1 (приложение А).
При наличии на хроматограмме концентрата пробы пика, идентифицированного как пик охратоксина А, делают вывод о присутствии охратоксина А в анализируемой пробе, определяют его содержание по каждой зарегистрированной хроматограмме и проверяют расхождение полученных значений между собой, используя формулу (2).
Если условие формулы (2) выполняется, то в качестве результата измерений массовой концентрации охратоксина А в концентрате анализируемой пробы принимают среднеарифметическое значение полученных массовых концентраций. Если условие формулы (2) не выполняется, то находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод концентрата анализируемой пробы повторяют.
При необходимости подтверждения правильности идентификации пика охратоксина А рекомендуется добавить стандартный градуировочный раствор охратоксина А к концентрату анализируемой пробы. О достоверности идентификации можно судить по увеличению высоты предполагаемого пика охратоксина А. Количество добавляемого раствора охратоксина А определяют, исходя из того, что массовая доля охратоксина А в пробе должна увеличиться на 50%-150% по сравнению с исходным значением.
Если массовая концентрация охратоксина А в конечном концентрате, , превышает 100 нг/см
, то его необходимо разбавить подвижной фазой (см. 7.4.2). Коэффициент разбавления,
, вычисляют по формуле
, (6)
где - объем разбавленного концентрата анализируемой пробы, см
;
- объем аликвотной порции концентрата анализируемой пробы, взятый для разбавления, см
.