ГОСТ ISO 22119-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения

     9 Процедура

9.1 Пробоподготовка

Экстракция нуклеиновых кислот и/или очистка тестового образца должны осуществляться в соответствии с методом, изложенным в ISO 20837 [1].

В результате, раствор нуклеиновых кислот должен содержать достаточное количество целевой нуклеиновой кислоты достаточно высокого качества так, чтобы для качественного анализа от одного до 10 целевых микроорганизмов или эквивалентов вирусных геномов были определены в тестовой пробе. Обогащение и/или концентрация целевого микроорганизма или вируса обычно требует для качественного анализа небольшое число целевых организмов в тестовой порции.

В результате раствор нуклеиновых кислот должен содержать вещества, которые не ингибируют ПЦР, не создают помех для флуоресценции.

Примечание - Флуоресценция зачастую происходит из окрашенных реакционных емкостей и некоторых ингредиентов обогащенных бульонов.

Количественный анализ требует процедуры подготовки образцов, гарантирующей, что количество нуклеиновых кислот целевых микроорганизмов или вирусов в конечном растворе нуклеиновых кислот высоко воспроизводимое.

9.2 Амплификация

9.2.1 Общие положения

Амплификация специфических нуклеиновых кислот осуществляется in vitro с помощью реакции, катализируемой ДНК-полимеразой в присутствии олигонуклеотидов, праймеров, дезоксинуклеозид трифосфатов и флуоресцентных зондов в определенном буфере реакции.

В дополнение к стандартной ПЦР, при постановке реакционной смеси необходимо избегать использования цветных наконечников и реакционных емкостей. Следует принять меры для предотвращения контаминации частицами пыли вне реакционных сосудов.

Сигнал флуоресцентного зонда контролируется на протяжении всего процесса амплификации.

РНК может быть обнаружена с помощью ПЦР в реальном времени, если последовательность была изначально транскрибирована в комплементарную последовательность ДНК с помощью обратной транскрипции.

9.2.2 Параметры циклеров

9.2.2.1 Зонды гидролиза

В целом, процесс амплификации использует протокол двухступенчатого цикла с денатурацией и комбинированными праймерами и зондами отжига и шагом элонгации. Флуоресцентный сигнал контролируется на протяжении отжига и шага элонгации.

9.2.2.2 Зонды гибридизации

Процесс амплификации использует протокол трехступенчатого цикла с денатурацией, праймерами и зондами отжига и шагом элонгации. Флуоресцентный сигнал контролируется во время отжига.

9.2.2.3 Молекулярные маяки

В целом, процесс амплификации использует протокол трехступенчатого цикла с денатруацией, праймерами и молекулярными маяками отжига и шагом элонгации. Флуоресцентный сигнал контролируется во время отжига.

9.3 Оценка результатов

Оценка результатов испытания - по ISO 22174.

ПЦР в реальном времени позволяет одновременно определить и разделить сигналы специфических патогенов и внутреннего контроля амплификации. Следовательно, рекомендуется использовать внутренний контроль амплификации.

9.4 Анализ данных флуоресценции

9.4.1 Участок амплификации

9.4.1.1 Общие положения

В процессе амплификации количество обнаруживаемых ПЦР-продуктов увеличивается. Увеличение флуоресцентного сигнала связано с увеличением количества ПЦР-продуктов. Это может быть графически изображено на кривой амплификации (см. рисунок 4).

Обозначение