ГОСТ ISO 22119-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения

     4 Принципы

4.1 Общие положения

ПЦР в режиме реального времени обычно состоит из:

a) амплификации специфической целевой последовательности с помощью ПЦР в присутствии флуоресцентных зондов;

b) связывания флуоресцентных зондов в каждом цикле амплификации;

c) генерации флуоресцентного сигнала при возбуждении во время каждого цикла;

d) контроля флуоресценции сигналов оптической системой обнаружения;

e) анализа данных.

Примечание - Для целей скрининга могут быть использованы флуоресцентные сигналы от красителей, связанных с двойной молекулой ДНК.

4.2 Зонды для ПЦР в режиме реального времени

4.2.1 Гидролизуемые зонды

Зонды гидролиза представляют собой специфические олигонуклеотиды, присутствующие в ПЦР вместе с праймерами для ПЦР. Один конец зонда несет флуоресцентную молекулу репортерного гена со спектром излучения, который гасится второй молекулой, находящейся на другом конце.

Зонд гибридизуется с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты. На этапе элонгации цепи ДНК, 5'-3'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы расщепляет гибридизованный зонд. После расщепления репортерный ген отделяется от гасителя, в результате чего интенсивность флуоресценции репортера увеличивается. Конечный сигнал флуоресценции пропорционален количеству специфичного ПЦР-продукта.

3'-конец зонда должен быть заблокирован, чтобы предотвратить его распространение в ПЦР.

4.2.2 Зонды гибридизации

Два гибридизационных зонда представлены в ПЦР как специфические олигонуклеотиды, связанные с праймерами ПЦР. Эти зонды, каждый из которых содержит флуоресцентные молекулы, одна из которых выступает в качестве донора, другая в качестве акцептора, гибридизуются с целевой последовательностью нуклеиновых кислот. После гибридизации красители оказываются в непосредственной близости так, что при возбуждении происходит флуоресцентно-резонансный перенос энергии, и молекула акцептора генерирует сигнал, который можно обнаружить, конечный сигнал флуоресценции пропорционален количеству специфичного ПЦР-продукта.

3'-конец зонда должен быть заблокирован, чтобы предотвратить его распространение в ПЦР.

4.2.3 Молекулярные маяки

Молекулярные маяки представляют собой специфические олигонуклеотиды, присутствующие в ПЦР вместе с праймерами для ПЦР.

Когда молекулярные маяки связываются с комлементарной целевой последовательностью при определенной температуре гибридизации, они подвергаются конформационной трансформации, которая приводит к разделению ствола. Это приводит к образованию гибрида зонда и мишени, который является более длинным и стабильным, чем ствол. Это в свою очередь приводит к разделению репортерного гена и гасителя, в результате чего репортер генерирует сигнал [3]. Конечный сигнал флуоресценции пропорционален количеству специфичного ПЦР-продукта.