ГОСТ ISO 22119-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения

     3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяются следующие термины с соответствующими определениями.

3.1 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени: Ферментативная реакция, сочетающая в себе амплификацию специфичных сегментов ДНК в процессе денатурации, отжиг специфичных праймеров и синтез ДНК с обнаружением специфичных ПЦР продуктов в течение процесса амплификации.

Примечания

1 Как правило, смесь для реакции амплификации содержит одну или несколько проб специфичной ДНК в сочетании с одним или несколькими флуоресцентными красителями. При использовании данной технологии сигнал генерируется после специфичной гибридизации проб с целевой последовательностью нуклеиновых кислот и возбуждения светом определенной длины волны.

2 При проверке положительных результатов в соответствии с ISO 20838 могут использоваться неспецифично связывающиеся с ДНК флуоресцентные красители.

3.2 ПЦР-продукт: Фрагмент ДНК, амплифицированный в ПЦР.

3.3 флуоресцентно-резонансный перенос энергии: (обнаружение патогенов в продуктах питания с помощью ПЦР) зависящая от расстояния передача энергии от молекулы донора к молекуле акцептора, приводящая к повышению флуоресценции молекулы акцептора при возбуждении электромагнитного излучения определенной длины волны.

Примечание - Источник: [2].

3.4 репортер: (обнаружение патогенов в продуктах питания с помощью ПЦР) Флуоресцентные молекулы, использующиеся для обнаружения гибридизации специфических зондов при возбуждении электромагнитного излучения определенной длины волны.

3.5 гаситель: (обнаружение патогенов в продуктах питания с помощью ПЦР) флуоресцентные молекулы, выступающие в качестве акцептора энергии и тем самым гасящие/выключающие флуоресцентный сигнал от репортерного гена (донора).

3.6 темный гаситель: Молекула, выступающая в качестве акцептора, не излучает энергию в спектральном диапазоне, который может быть обнаружен оптической системой обнаружения прибора ПЦР в реальном времени.

3.7 5'-3'-экзонуклеазная активность: Способность фермента, например, полимеразы нуклеиновых кислот, расщеплять гибридизованные молекулы нуклеиновой кислоты в направлении 5'-3'.

Примечание - Активность 5'-3'-экзонуклеазы направлена на двойную скрученную цепь ДНК. Она зависит от типа фермента и может быть представлена, например, Taq-, Tth и TFL-полимеразами.

3.8 флуоресцентный зонд: Олигонуклеотид или аналог олигонуклеотида определенной последовательности в сочетании с одной или несколькими флуоресцентными молекулами.

Примечание - Любая система, излучающая флуоресцирующий сигнал после специфической гибридизации с целевой последовательностью нуклеиновых кислот, может быть использована в качестве флуоресцентного зонда.

3.9 гидролизуемый зонд: Флуоресцентный зонд в сочетании с двумя флуоресцентными молекулами, которые пространственно отделены друг от друга 5'-3'-экзонуклеазной активностью фермента в процессе амплификации.

Примечание - Принцип гидролизуемого зонда изображен на рисунке 1.

а) Негибридизованный зонд в растворе

б) Расщепление гибридизованного зонда

с) Результат расщепления зонда после возбуждения флуоресценции репортера

Обозначение

1 - ДНК субстрат.

2 - Флуоресцентные молекулы (репортер).

3 - Гасящие молекулы.