ГОСТ ISO 22119-2013 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения

     6 Реактивы и материалы

6.1 Общие положения

В ходе анализа, если не указано иное, используют только реагенты, признанные чистыми для анализа, и стерильную дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты, свободную от нуклеиновых кислот и нуклеаз, подходящие для молекулярного биологического анализа.

Не допускается использование любых реагентов или расходных материалов, например, компонентов обогащенных бульонов, флуоресценция которых интерферирует с системой обнаружения.

Особые требования применяются к реагентам, указанным в пунктах 6.2-6.6.

6.2 ДНК-полимераза и реакционный буфер

6.2.1 ДНК-полимераза

Термостабильная полимераза (возможно, с активностью обратной транскриптазы), используемая для ПЦР. Она должна быть использована в соответствии с указаниями производителя.

Примечание - Она может быть очищенной, в виде нативного фермента, или очищенной, генетически модифицированной рекомбинантной формой фермента.

Если будут использоваться зонды гидролиза, ДНК-полимераза должна обладать 5'-3'-экзонуклеазной активностью. Для анализа РНК требуется смесь обратной транскриптазы и ферментов ДНК-полимеразы или ДНК-полимераза с активностью обратной транскриптазы.

Каждая ДНК-полимераза может требовать различных экспериментальных условий.

6.2.2 Реакционный буфер

Реакционный буфер должен соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.

6.3 Дезоксирибонуклеотид трифосфаты (dNTPs) для ПЦР

dNTPs должны соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.

6.4 Праймеры

Праймеры должны соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.

6.5 Флуоресцентные зонды для обнаружения в режиме реального времени

Олигонуклеотиды должны быть надлежащего качества и должны быть предназначены для обнаружения последовательности, присущей специфическому ПЦР-продукту. Последовательность зонда должна быть высоко комплиментарна целевой последовательности ДНК.

6.6 Внутренний контроль амплификации

Эффективность амплификации тестового образца может быть проверена с помощью фрагмента ДНК контроля, добавленного в ту же реакционную емкость, что и эксрагированная ДНК из тестового образца. Также возможно использовать те же пары праймеров для амплификации фрагмента контрольной ДНК, как и для амплификации целевой ДНК (гомологичный внутренний контроль амплификации) или другую пару праймеров (гетерологичный внутренний контроль амплификации). Система с целевым геном и система с внутренним контролем амплификации должны в результате показать приблизительно равную эффективность амплификации. Концентрация добавленного фрагмента контрольной ДНК должна быть как можно более низкой, чтобы обнаружить даже небольшое ингибирование и в то же время дать статистически воспроизводимый положительный результат. Далее, должно быть установлено, что внутренний контроль амплификации не влияет на уровень обнаружения целевого гена.

Следующие положения снижают риск негативных влияний на уровень обнаружения:

- эффективность амплификации гомологичного внутреннего контроля амплификации несколько ниже, чем целевой ДНК;

- снижение концентрации праймеров для гетерологичного внутреннего контроля амплификации.

Контроль внутренней амплификации может добавляться в образцы на ранней стадии анализа, и, следовательно, в то же время выступать в качестве контроля процедуры экстракции.

6.7 Реагенты для предотвращения механической контаминации

Реагенты для предотвращения механической контаминации должны соответствовать требованиям, изложенным в ISO 20838.