ГОСТ Р 54330-2011 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности (издание 2018 г. с Изменениями N 1, 2, Поправкой)

     5 Метод определения глюкоамилазной активности (ГлС)

5.1 Характеристика метода

5.1.1 Метод основан на количественном определении глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала глюкоамилазой в стандартных условиях (температура 30°С, значение рН 4,7, продолжительность гидролиза 10 мин).

5.1.2 Глюкоамилазная активность (ГлС) характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы и выражается числом единиц активности в 1 г (1 см) препарата.

5.1.3 За единицу глюкоамилазной активности принято такое количество фермента, которое способно катализировать гидролиз растворимого крахмала при температуре 30°С и значении рН 4,7, высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы. Активность выражается в ед. ГлС/г (для порошкообразного) или ед. ГлС/см (для жидкого) анализируемого ферментного препарата.

5.1.4 Количество глюкозы, образующейся в результате ферментативного гидролиза крахмала, определяют глюкозооксидазным методом, основанным на действии ферментов глюкозооксидазы и пероксидазы.

Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление -D-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах, эквимолярных окисленной глюкозе. Перекись водорода под действием фермента пероксидазы окисляет ферроцианид калия (калий железистосинеродистый), который переходит в феррицианид калия, окрашенный в лимонно-желтый цвет, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству глюкозы.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

5.2.1 Для определения глюкоамилазной активности применяют средства измерений, аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы, указанные в 4.2.1, со следующими дополнениями:

- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр любого типа, которые обеспечивают измерения при длине волны 400 нм с погрешностью измерения коэффициента пропускания ±1% (не более 0,01 единицы оптической плотности) в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;

- калий железистосинеродистый по ГОСТ 4207;

- D(+)-глюкозу по ГОСТ 6038;

- натрий уксуснокислый по ГОСТ 199;

- калия гидроокись (кали едкое) по ГОСТ 24363;

- глюкозооксидазу с активностью 100000-250000 ед./г;

- пероксидазу с активностью 250000-300000 ед./г;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

5.2.2 Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.).

5.2.3 Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.3 Подготовка к анализу

5.3.1 Приготовление раствора крахмала массовой долей 1,0% (субстрат)

1,00 г крахмала в пересчете на абсолютно сухое вещество, учитывая влагу по ГОСТ Р 55802, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, добавляют 25 см дистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 см воды, помещают колбу с содержимым в кипящую водяную баню не менее чем на 15-20 мин, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см ацетатного буферного раствора с рН 4,7 по 5.3.2, объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20°С и содержимое колбы перемешивают. Для полученного раствора крахмала характерна легкая опалесценция.

Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

5.3.2 Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 1 моль/дм с pH 4,7 из растворов уксуснокислого натрия и уксусной кислоты

Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 1 моль/дм с рН 4,7 из  растворов уксуснокислого натрия и уксусной кислоты проводят по 4.3.2.

(Измененная редакция, Изм. N 2).

5.3.3 Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрации 1,0 моль/дм с рН 7,5 из растворов калия фосфорнокислого однозамещенного и едкого калия

5.3.3.1 Приготовление раствора  с () молярной концентрации 1,0 моль/дм (раствор А)