ГОСТ Р ИСО 21871-2010 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа Bacillus cereus
9 Методика проведения испытания
9.1 Метод подсчета
9.1.1 Анализируемая проба, исходная суспензия и порядок разбавления разведения - по ИСО 6887, в зависимости от конкретного продукта, или ИСО 8261.
Примечание - Для подсчета только презумптивных бактерий Bacillus cereus исходное разбавление может быть нагрето на водяной бане (6.4) при температуре 80 °С в течение 10 мин.
9.1.2 Инокуляция и инкубация
Инокулируют три пробирки, каждая из которых содержит среду двойной концентрации [5.3.1.1 а)], в каждую добавляют по 10 см исходного разбавления (начальная суспензия) (равной 1 г пробы в каждой пробирке) и перемешивают пробы со средой при помощи перемешивающего устройства для пробирок (6.8).
Инокулируют три пробирки, каждая из которых содержит среду единичной концентрации [5.3.1.1 b)], 1 см в каждую пробирку исходного разбавления (начальная суспензия) (равной 0,1 г пробы в каждой пробирке) или последующих разбавлений (равных 0,01 г, 0,001 г и т.д. пробы в каждой пробирке) и перемешивают пробы со средой при помощи перемешивающего устройства для пробирок (6.8).
Инкубируют пробирки в термостате (6.3) при температуре 30 °С в течение (48±4) ч.
9.1.3 Выделение чистой культуры
После тщательного перемешивания с использованием перемешивающего устройства для пробирок (6.8) делают посев культуры инокуляционной петли петлей из каждой пробирки на поверхность агара с полимиксином, пируватом, яичным желтком, маннитом и бромтимольным синим (РЕМВА) (5.4) или агара с маннитом, яичным желтком и полимиксином (MYP) (5.5).
Инкубируют чашки Петри с питательной средой крышками вниз при температуре 37 °С (РЕМВА) или 30 °С (MYP) 18-24 ч. Если колонии нельзя четко определить, продолжают выращивание в термостатах дополнительно в течение 24 ч. При использовании агара РЕМВА, дальнейшая инкубация может быть продолжена при комнатной температуре.
9.1.4 Отбор чашек Петри
9.1.4.1 Общие положения
После завершения инкубации чашки Петри исследуют на наличие типичных или атипичных колоний.
9.1.4.2 Типичные колонии
На РЕМВА типичные колонии презумптивных бактерий Bacillus cereus с размерами от 2 до 5 мм имеют неровные края с зазубринами и разветвлениями на гладкой стеклянной поверхности, имеют цвет от бирюзового до голубого (допускается беловато-серый цвет в центре колонии с синим фоном) и имеют ореол осадка (реакция на яичный желток) шириной до 5 мм.
На MYP типичные колонии имеют размеры от 2 до 5 мм и имеют зазубрины. Они обладают розовой окраской, темно-красным фоном и окружены ореолом осадка (реакция на яичный желток) шириной до 5 мм.
9.1.4.3 Атипичные колонии
Если на чашках Петри имеется неоднородный рост бактерий, которые ферментируют маннит, характерная окраска колоний и фон могут быть ослаблены или стать невидимыми.
Некоторые штаммы презумптивных бактерий Bacillus cereus обладают слабой реакцией на яичный желток или не обладают никакой реакцией. В подобных случаях и в других сомнительных случаях такие колонии подлежат дополнительной проверке.
9.1.5 Подтверждение
9.1.5.1 Общие положения
Типичные колонии (9.1.4.2) и атипичные колонии (9.1.4.3) на РЕМВА или MYP должны быть подтверждены посредством испытания с помощью гемолиза на агаре с бараньей кровью. В качестве альтернативы типичные колонии на среде РЕМВА или среде MYP проверяют с использованием микроскопа.
9.1.5.2 Отбор и очистка колоний для подтверждения
Отбирают по три колонии с каждой чашки Петри, выбранные по 9.1.4. Если на поверхности агара находится менее трех колоний, отбирают все имеющиеся колонии. Это очень спорное утверждение. Данные колонии проверяются по 9.1.5.3 или 9.1.5.4.
Если на чашках Петри получен сплошной рост микроорганизмов по линии пересева, то отбирают посевной материал из трех точек этого пересева и проводят посев на другие чашки Петри, содержащие твердую селективную среду (5.4 или 5.5). Эффективней предварительно перед посевом отобранный материал развести. Если слои переполнены колониями и нет возможности отобрать четко изолированные колонии, отбирают материал колоний из трех точек и производят посев на слоях, содержащих твердую селективную среду (5.4 или 5.5). Инкубируют в термостате (6.3) при температуре 37 °С (РЕМВА) или при 30 °С (MYP) от 18 до 24 ч. Отбирают с каждого слоя по меньшей мере одну четко изолированную колонию. Подтверждают эти колонии, как это указано в 9.1.5.3 или 9.1.5.4.
9.1.5.3 Подтверждение тестом с гемолизом на агаре с бараньей кровью (MYP или РЕМВА)
Проводят посев отобранных (9.1.4.2 или 9.1.4.3) с MYP или РЕМВА колоний на поверхность агара с бараньей кровью (5.7) таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний и дать возможность четко разделенным колониям развиваться.
Инкубируют при температуре 30 °С в течение 24 ч и фиксируют реакцию гемолиза.