ГОСТ Р 52840-2007 Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле

     8 Проведение анализа

8.1 Приготовление проб для анализа

8.1.1 Мышечную ткань исследуемого образца и референс-образца освобождают от крови, темных мышц. Навеску массой (5,0±0,1) г светлой мышечной ткани рыбы-сырца, филе или сырого фарша измельчают в течение 30 с в ступке с 5 см дистиллированной воды.

8.1.2 Смесь, полученную по 8.1.1, переносят в центрифужные пробирки вместимостью 50 см и центрифугируют при температуре 4 °С в рефрижераторной центрифуге при частоте вращения 4000 мин в течение 15 мин.

8.1.3 Надосадочную жидкость, полученную по 8.1.2, переносят в центрифужные пробирки вместимостью 10 см и центрифугируют при температуре 4 °С в рефрижераторной центрифуге при частоте вращения 12000 мин в течение 15 мин.

8.1.4 Надосадочную жидкость, полученную по 8.1.3, фильтруют через бумажный фильтр в колбу. Полученный прозрачный раствор используют для проведения ИЭФ.

8.2 Приготовление раствора стандартных образцов

Готовят раствор стандартных калибровочных белков в дистиллированной воде в зависимости от диапазона рН, выбранного для анализа: в 30-40 мкл дистиллированной воды для окрашивания кумасси и в 2 см дистиллированной воды для окрашивания серебром.

8.3 Проведение изоэлектрофокусирования на приборе

8.3.1 Включают систему.

8.3.2 Помещают полиакриламидный гель в систему в соответствии с инструкцией, прилагаемой к ней.

8.3.3 Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращенными вверх, кладут на стол; накрывают парафиновой пленкой защитным покрытием вверх (по направлению линий отверстий); в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.

8.3.4 Растворы, полученные по 8.1.4 из анализируемого образца и референс-образца, а также раствор стандартного набора калибровочных белков с известной изоэлектрической точкой, выбранный в зависимости от заложенного в программе диапазона рН, вносят микродозатором в лунку в количестве 1,5 мкл.

8.3.5 Аппликатор опускают на поверхность растворов исследуемого образца, референс-образца и стандартного набора калибровочных белков, помещенных в лунки, сформированные в парафиновой пленке с помощью штампа по 8.3.3, нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.

8.3.6 Аппликатор, наполненный образцами по 8.3.5, помещают в систему со стороны катода и проводят ИЭФ в автоматическом режиме на полиакриламидных гелях по программам в соответствии с таблицами 1 и (или) 2.

Таблица 1 - Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в широком диапазоне рН 3,0-9,0

Таблица 2 - Программа проведения анализа ИЭФ в полиакриламидном геле в узких диапазонах рН: 5,0-8,0 или 4,0-6,5

Выбор программы зависит от цели анализа: для выбора оптимального диапазона рН при измерении иэоэлектрических точек используют широкий диапазон рН 3,0-9,0, для характеристики и анализа белков с небольшими различиями в изоэлектрической точке используют более узкие диапазоны: рН 5,0-9,0 и рН 4,0-6,5.

Программы проведения изоэлектрофокусирования в широком и узких диапазонах рН состоят из трех этапов:

- префокусирование (происходит формирование градиента рН);

- этап нанесения исследуемых образцов (белки вносятся в гель);

- этап разделения (белки мигрируют к своим изоэлектрическим точкам).

Этап фокусирования продолжается от 8 до 10 мин. Общее время ИЭФ составляет около 30 мин.