МУК 4.2.2046-06

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе,
 нерыбных объектах промысла, продуктах, вырабатываемых из них,
воде поверхностных водоемов и других объектах

     

Дата введения 2006-04-01

1. РАЗРАБОТАНЫ: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.М.Федоров); ФГУЗ Ростовский-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательский противочумный институт (Ю.М.Ломов, Б.Н.Мишанькин, Л.М.Смоликова, Л.Г.Воронежская, Л.С.Подосинникова, А.Е.Либинзон, Е.М.Санамянц, Е.Н.Голенищева, Н.В.Божко, Н.Г.Пузанова, А.Б.Мазрухо, Д.И.Каминский); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (И.В.Брагина, Э.Ф.Опочинский, Н.С.Кривопалова); ФГУЗ Причерноморская противочумная станция (Г.В.Гальцева); ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН (С.А.Шевелева).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 октября 2005 г. (протокол N 3).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 30 января 2006 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Методических указаний по контролю за содержанием в рыбных продуктах парагемолитических вибрионов - возбудителей пищевых токсикоинфекций" N 5780-91 от 03.04.91.

1. Область применения

1.1. Методические указания устанавливают порядок выявления и определения парагемолитических вибрионов - возбудителей пищевых токсикоинфекций и острых кишечных заболеваний в рыбе, нерыбных объектах промысла, продуктах, вырабатываемых из них, воде поверхностных водоемов и других объектах при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля), а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут использоваться другими организациями, аккредитованными в установленном порядке.

2. Парагемолитические вибрионы - возбудители пищевых токсикоинфекций

Парагемолитические вибрионы - условно патогенные галофильные микроорганизмы семейства Vibrionaceae, обитающие в соленых водоемах. Выделяют их из морской воды, рыб, креветок, мидий, устриц, омаров, крабов. Впервые V. parahaemolyticus стал известен как причина крупной вспышки токсикоинфекции в Японии в 1950 г., связанной с употреблением в пищу слабосоленой рыбы. Крупные вспышки отмечены в 1984-1986 гг. на побережье Черного и Азовского морей в городах Бердянске, Мариуполе, Николаеве, Керчи. Спорадические заболевания имели место на побережье Балтийского и Японского морей, соленых озер Узбекистана и Туркмении. Во Владивостоке в 1997, 2001 гг. зарегистрированы вспышки острой кишечной инфекции, обусловленные вибрионами этого вида. Фактором передачи инфекции явились варено-мороженые креветки и другие морепродукты. В 2001 г. в Запорожской области Украины отмечены групповые острые кишечные заболевания, связанные с употреблением кильки сухого посола, контаминированной парагемолитическими вибрионами.

Опасность заражения парагемолитическими вибрионами существует везде, где население использует в питании продукты моря. Заболевания возникают, в основном, в теплое время года, зачастую в момент массового отлова рыбы, моллюсков, ракообразных. В местах, удаленных от побережья, отмечены заболевания, связанные с завозом инфицированных продуктов моря. Риск возникновения заболеваний увеличивается с ростом импортируемой продукции из регионов, потенциально опасных по возможности возникновения вспышек пищевых токсикоинфекций, обусловленных парагемолитическими вибрионами. Зарегистрированы случаи выделения парагемолитических вибрионов от больных острыми кишечными инфекциями, из гидробионтов, водоемов и в пресноводном регионе (дельте Волги). Отмечены случаи вторичного инфицирования овощных продуктов при обработке их водой, содержащей парагемолитические вибрионы. Острые кишечные заболевания, вызываемые V. parahaemolyticus, относят к пищевым токсикоинфекциям (ПТИ), возникающим при употреблении в пищу продуктов, в которых произошло массовое размножение микроорганизмов-возбудителей и накопление их токсинов. У парагемолитических вибрионов известны термостабильный прямой гемолизин (ТПГ), детерминируемый tdh-геном, термолабильный гемолизин и неидентифицированный энтеротоксин. Инфективная доза возбудителя составляет 10-10 вибрионов в 1 грамме продукта. Особую опасность представляют сырые гидробионты, в которых концентрация V. parahaemolyticus может достигать 10 в грамме, а также продукты, подвергнутые недостаточной кулинарной обработке. Хотя парагемолитические вибрионы чувствительны к высокой температуре, находясь внутри больших кусков рыбы или крупных крабов, они могут выдерживать термическую обработку. Время генерации этого микроорганизма составляет 12 мин при температуре 30-37 °С, поэтому при неправильном хранении вибрионы довольно быстро размножаются с накоплением экзотоксинов в продуктах. Употребление их в пищу приводит к развитию токсикоинфекции. В малосоленой и недовяленной рыбе при определенной температуре вибрионы не только сохраняются, но и размножаются.

Требования к качеству рыбы, нерыбных объектов промысла и продуктов, вырабатываемых из них, определены СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

Одним из микробиологических показателей оценки безопасности этих продуктов является V. parahaemolyticus. Определение его осуществляется по массе продукта, в которой не допускается присутствие парагемолитических вибрионов, или по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г продукта.

Исследование рыбы и морских беспозвоночных на присутствие парагемолитических вибрионов проводят в порядке текущего надзора (контроля) на этапах производства и реализации, по эпидемическим показаниям, а также в случае возникновения неблагоприятной экологической ситуации в регионе лова рыбы, моллюсков и ракообразных.

При выявлении в прибрежных морских зонах спорадических или групповых случаев заболевания, обусловленных парагемолитическими вибрионами, а также при возникновении неблагоприятной экологической ситуации проводят исследование воды открытых водоемов и обитающих в них гидробионтов, а также свежевыловленных гидробионтов в местах их организованной и неорганизованной реализации.

3. Отбор проб для микробиологического анализа

Микробиологическому анализу подлежат: сырье, используемое для производства различных видов рыбной продукции, употребляемые в пищу в сыром виде продукты моря, различные виды готовой продукции, соленая, вяленая, копченая рыба, консервы, икра и т.д. в соответствии с перечнем групп продуктов в санитарно-эпидемиологических правилах и нормативах СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", разделе 1.3. Отбор проб и подготовку к исследованию осуществляют согласно ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний", а также "Инструкции по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных" N 5319-91 от 22.02.91, утв. МЗ СССР, и справочника "Санитарная микробиология" (1998 г.) Пробы для бактериологического исследования собирают до изъятия образцов для органолептического и химического анализа.

Пробы продуктов отбирают асептическим способом, исключающим микробное загрязнение из окружающей среды, и переносят в стерильную посуду или на стерильную бумагу, фольгу с помощью стерильных инструментов (ножа, пинцета, ложки, пробоотборника). Масса (объем) пробы, устанавливаемая в соответствии с нормативно-техническими документами на конкретный вид продукции, должна быть достаточной для выполнения микробиологического анализа и соответствовать требованиям санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", определяющим допустимые концентрации этих микроорганизмов в 1 г исследуемого продукта или отсутствие их в навеске 25 г. Общая масса пробы должна быть около 200 г, а икры - 25 г.

Из каждой партии крупной рыбы: свежей, охлажденной, мороженой, соленой, пряной, маринованной, сушеной, вяленой, копченой и крупных экземпляров морских беспозвоночных отбирают не более 3-х штук. От каждого экземпляра из нескольких мест вырезают кусочки с кожей и мышцами, мелкую рыбу (3-10 штук) берут целиком из разных мест исследуемой партии. Гидробионтов (мелких рыб, мидий, устриц, креветок, крабов) отлавливают и доставляют в лаборатории в ведрах, банках или других сосудах с водой, в которой они находились до отлова. Морскую воду для качественного исследования отбирают в объеме 1,0 л, а для количественного - в объеме 200 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой. В лабораторию пробы доставляют в опечатанном виде с сопроводительными документами. Материал исследуют немедленно после доставки.

Порядок отбора, доставки и исследования материала от больного, проб воды и других объектов описан в методических указаниях МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры" и МУК 4.2.1793-03 "Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами".

4. Подготовка проб к исследованию

Из поступивших в лабораторию проб продуктов берут навеску 25 г, измельчают и гомогенизируют в размельчителе тканей (например, блендере, гомогенизаторе типа Stomacher со стерильными пакетами или других с аналогичными характеристиками, разрешенных к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке) или тщательно растирают в стерильной ступке с 2-3 г стерильного кварцевого песка.

При количественном определении парагемолитических вибрионов измельченную навеску переносят в стерильную колбу с 225 мл 0,1%-го раствора пептонной воды с 3% натрия хлорида (п.7.2.1.2), получая исходное разведение 1:10. Взвесь тщательно взбалтывают, не допуская намокания пробки, дают отстояться и из надосадочной жидкости готовят десятикратные разведения (1:100, 1:1000) путем последовательного переноса по 1,0 мл из предыдущего разведения в 9,0 мл разводящей жидкости, каждый раз меняя пипетку для смешивания и переноса взвеси. В качестве разводящей жидкости могут быть использованы 0,1%-й раствор пептона с 3% натрия хлорида или фосфатный буферный раствор (п.7.2.1.1). При контроле на соответствие СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" готовят десятикратные разведения до 10, а при расследовании вспышек пищевых токсикоинфекций (ПТИ) - до разведения 10. Во избежание ошибок при количественном определении парагемолитических вибрионов интервал между приготовлением разведений исследуемого продукта и посевом на питательные среды должен быть не более 45 мин.

Для определения присутствия (отсутствия) парагемолитических вибрионов в исследуемой пробе всю гомогенизированную навеску в 25 г переносят в 125 мл жидкой среды обогащения - 1%-й пептонной воды с 3% натрия хлорида и ингибиторами роста сопутствующей микрофлоры или без них. Исследования проводят с соблюдением требований санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами" в лабораториях, имеющих лицензии на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности.

5. Схема бактериологического анализа

Метод основан на выявлении в посевах исследуемого материала на элективных агаровых средах колоний, подозрительных на парагемолитические вибрионы, последующего выделения из них чистой культуры и идентификации ее по набору признаков, определяющих принадлежность к виду V. parahaemolyticus.

В работе используют готовые питательные среды, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке, и лабораторного изготовления. Обогатительные и элективные среды должны содержать натрия хлорида до 3%, а дифференциально-диагностические - от 1,5 до 3,0%.

5.1. Исследование пищевых продуктов

Порядок исследования и содержание работы по этапам схематически представлены на рис.1.

Рис.1

     
СХЕМА
бактериологического исследования пищевых продуктов на парагемолитические вибрионы

Обозначения: п.в. - пептонная вода; ПУС - полиуглеводная среда; ЩА - щелочной агар; ЭС - элективная среда.

При количественном анализе из разведений пробы 1:10, 1:100 и 1:1000 высевают по 0,1 мл на 2 чашки с элективной агаровой средой, например: питательной средой элективно-дифференциальной для выделения холерного вибриона сухой - СЭДХ - ВФС 42-411 ВС-93, селективной средой для выделения патогенных вибрионов - TCBS или дифференциально-диагностический агар с пенициллином - ДДА (п.7.2.1.6.) Посевной материал распределяют по поверхности агара и дают подсохнуть. Посевы помещают в термостат при (37±0,5) °С на 18-24 ч.

При качественном анализе посевы в накопительные среды инкубируют при (37±0,5) °С в течение 18-20 ч, после чего делают высев петлей с поверхностного слоя обогатительной среды на 1-2 чашки элективной среды для получения роста в виде изолированных колоний.

5.1.1. Отбор колоний и идентификация выделенных культур

Изучают рост на элективных средах, отбирают подозрительные на парагемолитические вибрионы колонии. При количественном анализе для подсчета отбирают чашки с посевом двух последовательных разведений, где выросло не более 300 колоний. Необходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. С каждой из 4-х отобранных для подсчета чашек отсевают по 5 колоний. Парагемолитические вибрионы на элективной среде формируют колонии правильной округлой формы, плосковыпуклые, полупрозрачные в проходящем свете с влажной блестящей поверхностью размером 2-3 мм в диаметре, не отличающиеся по цвету от голубовато-зеленого цвета элективных сред (СЭДХ, TCBS, ДДА), т.к. вибрионы этого вида не ферментируют сахарозу, входящую в них. Подозрительные колонии отсевают на щелочной агар - питательную среду для выделения и культивирования холерного вибриона, сухую (ФС 42-213 ВС-88) и на одну из полиуглеводных сред Ресселя (п.7.2.1.7), Клиглера (ФС 42-3387-97) или другие с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичным для парагемолитических вибрионов ростом. На среде Ресселя и Клиглера отмечают характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части агара.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, изучают на наличие цитохромоксидазы. Из оксидазопозитивных готовят мазки по Граму.

Для дальнейшей идентификации отбирают оксидазопозитивные грамотрицательные культуры с характерным ростом на полиуглеводных средах. Отобранные культуры изучают по набору признаков (подвижность, лизиндекарбоксилаза, аргининдигидролаза, индол, рост в средах с различными концентрациями натрия хлорида, ферментация/окисление глюкозы на среде Хью и Лейфсона (п.7.2.1.8), арабинозы, сахарозы, целлобиозы, салицина, реакция Фогес-Проскауэра), методами, описанными в разделе 6 и методических указаниях МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры".

При расследовании случаев заболевания, обусловленных V. parahaemolyticus, выделенные культуры изучают по расширенному набору признаков, приведенному в табл.1, а также по тестам внутривидовой дифференциации: серотипированию и феномену Канагава.

Таблица 1

     
Свойства парагемолитических вибрионов и сходных с ними микроорганизмов