ГОСТ ISO 20838-2014 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Требования к амплификации и обнаружению для качественного анализа

     7 Процедура

7.1 PCR-амплификация

Амплификация определенных нуклеотидных последовательностей может произойти в пробирке во время реакции, катализируемой к ДНК-полимеразой в присутствии олигонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в определенных буферах реакции. Важным условием для амплификации целевой последовательности является отсутствие ингибирования ДНК-полимеразы в реакции. Амплификация ДНК-циклический процесс, состоящий:

a) из денатурации двухспиральной ДНК в одноцепочную нуклеиновую кислоту посредством нагревания;

b) отжига олигонуклеотидных праймеров с комплементарной целевой последовательностью на обоих концах одной нити ДНК, при подходящей температуре;

c) удлинения праймеров с дезоксирибонуклеозидтрифосфатами на ДНК-полимеразе при подходящей температуре.

РНК может быть обнаружена использованием PCR, если последовательность была сначала транскрибирована в комплементарную последовательность ДНК обратной транскриптазой.

7.2 Обнаружение и/или подтверждение продуктов PCR

Продукты PCR могут быть обнаружены электрофорезом в геле или соответствующим альтернативным средством. Размер продуктов PCR может быть определен в сравнении с продуктами PCR положительного контроля или с подходящей стандартной длиной ДНК.

Для анализа PCR в реальном времени, обнаружение происходит одновременно с амплификацией.

Для подтверждения идентичности продукта PCR применяются следующие методы, кроме определения размера:

a) секвенированием ДНК продукта PCR;

b) гибридизация продукта PCR со специфическими ДНК-зондами;

c) проведение рестрикционного анализа продуктов PCR; длина фрагментов после рестрикции должна соответствовать ожидаемой длине последовательности ДНК-мишени после рестрикции.

Положительный результат может быть подтвержден при помощи стандартизированного метода микробиологического исследования культур или подтверждающих методов, описанных в соответствующих международных стандартах.

7.3 Методы контроля

Качество, целостность и количество ДНК-матрицы влияют на результаты PCR, и как следствие на аналитические результаты.

Риск получения ложных положительных и/или ложных отрицательных результатов в процессе PCR должен включать соответствующие методы контроля. Частота использования должна быть определена как часть лабораторной программы гарантии качества. Внутренний или внешний контроль амплификации должен использоваться в каждом процессе PCR.

Могут применяться соответствующие справочные материалы и ссылки в культурных справочниках на качественные положительные или качественные отрицательные методы контроля.

7.4 Общие требования для реакций амплификации

Условия реакции и условия термоциклирования должны быть оптимизированы для каждой пары праймеров и/или системы. Когда любой PCR используется впервые на экстракте или суспензии, полученной из особой матрицы, необходимо продемонстрировать, что условия реакции подходят для достижения необходимого предела обнаружения. Предел обнаружения в PCR минимального количества ДНК-мишени должен получить сигнал. При оптимальной реакции требуются менее 40 циклов для амплификации целевых молекул, чтобы произвести продукт, который обнаруживается с помощью стандартных методов.

Специфика реакции должна быть улучшена в максимально возможной степени, например, при помощи PCR с использованием горячего старта. Горячий старт повышает специфику путем уменьшения побочных реакций, таких как амплификация нецелевых последовательностей во второстепенной ДНК (ошибочное праймирование) и олигомеризация праймеров.

7.5 Аспекты конструирования праймеров

При сравнении производительности конкретной PCR с производительностью другой PCR следует учитывать аспекты конструирования праймеров.

Последовательности праймеров должны иметь следующие характеристики:

a) длина каждого праймера должна составлять от 18 до 30 нуклеотидов;

b) соотношение GC:AT должно быть 50:50, если это возможно, или максимально близко к этому отношению;

c) отсутствие концентрации Gs и Cs в коротких сегментах праймеров (высокая внутренняя стабильность);

d) отсутствие комплементарного 3' конца во избежание формирования димеров праймера;

e) отсутствие внутренней вторичной структуры;