ГОСТ ISO 20838-2014 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Требования к амплификации и обнаружению для качественного анализа

     5 Реактивы

Используют аналитически чистые реактивы, подходящие для молекулярных биологических исследований. Рекомендуется брать аликвоты реакционных смесей, требуемых для метода PCR и хранить их при соответствующих условиях, например, при минус 20°C.

5.1 ДНК-полимеразы

Для PCR используют теплоустойчивые полимеразы (включая деятельность обратной транскриптазы). Это могут быть очищенный, природный фермент, или очищенные, генетически спроектированные рекомбинантные формы фермента.

Используют согласно инструкциям производителя.

Каждая ДНК-полимераза может требовать различных экспериментальных условий, например, буфер, температуру.

5.2 Обратная транскриптаза

Фермент используют для транскрипции РНК (рибонуклеиновая кислота) в комплементарной одноцепочной ДНК (кДНК), фермент должен усиливаться последующей PCR.

Фермент используют согласно инструкциям производителя.

5.3 Буфер реакции

Соответствующий буфер используют согласно инструкциям производителя ферментов. Материалы, используемые для подготовки буфера PCR, должны быть устойчивыми относительно условий хранения и переработки.

Используют согласно инструкциям производителя.

5.4 Дезоксирибонуклеозидтрифосфат (dNTp) для PCR

Растворы, содержащие молекулярные биологические классы dATP, dCTP, dGTP, dTTP и/или dUTP должны быть использованы по необходимости. Растворы не должны менять свойств во время хранения и при условиях PCR.

5.5 Праймеры

Праймеры должны быть выбраны на основе последовательности специально для обнаружения ДНК целевого микроорганизма.

5.6 Вода

Вода для амплификации не должна содержать ДНКазы и РНКазы. Подходит очищенная вода.

5.7 Хлорид магния (MgCI)

Хлорид магния применяется как компонент буфера реакции или как отдельный раствор.

5.8 Реактивы для обнаружения продуктов PCR

Реактивы, используемые для системы обнаружения, описанной в методе PCR, должны иметь соответствующее качество.

5.9 Дополнительные реагенты

5.9.1 Минеральное масло

Распределяется на реакционную смесь для минимизации испарения во время термического цикла.

5.9.2 Фасилитаторы

Вещества, такие как полиэтилен-гликоль или бычий сывороточный альбумин, которые могут быть добавлены к реакции PCR для снижения ингибирования реакции веществами, полученными из матрицы.

5.9.3 Ингибиторы РНКазы (рибонуклеазы)

В PCR в реальном времени ингибиторы используются для предотвращения разложения продукта, которого могут загрязнить реактивы или пластмассовую посуду, используемую в процедуре извлечения.

5.9.4 Реагенты для предотвращения переноса продуктов PCR