ГОСТ 32647-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности (Переиздание)

     4 Наблюдение

4.1 Фаза хронической токсичности

В начале и в конце каждого дня, включая выходные и праздники, необходимо осуществлять контроль заболеваемости и смертности всех животных, а также токсикологически значимые признаки. Общее клиническое наблюдение должно осуществляться, как минимум, один раз в день, предпочтительно в одно и то же время, принимая во внимание период максимума предполагаемого воздействия дозы, в случае применения введения через зонд.

Подробное клиническое обследование должно быть проведено, как минимум, один раз до начала воздействия (учитывая предмет исследования), к концу первой недели исследования и впоследствии ежемесячно. Протокол наблюдений должен быть согласован так, чтобы обеспечить минимальную разницу между отдельными наблюдателями, и независимость от тестовой группы. Эти обследования необходимо делать вне клетки постоянного пребывания, каждый раз в одном месте, в одно и то же время. Их следует тщательно фиксировать, желательно использовать систему количественных показателей, четко оговоренную испытательной лабораторией. Необходимо следить за тем, чтобы варьирование в условиях наблюдения было минимальным. Отмеченные признаки должны включать: изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, возникновение секреции и экскреции и автономной активности (например, слезоотделение, пилоэрекция, размер зрачка, аномальный способ дыхания) и т.д. Изменения в походке, положении тела, реакции на прикосновение, как и наличие клонических или тонических движений, стереотипы поведения (например, чрезмерное умывание, однообразные движения по кругу) или аномальное поведение (например, членовредительство, хождение задом наперед) также должны регистрироваться [33].

Офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента следует проводить всем животным до первого введения исследуемого вещества. По окончании исследования этот осмотр желательно провести всем животным, но, как минимум, группе с высокой дозой и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена.

Для химических веществ, для которых предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы через 28 дней и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать нейротоксическое воздействие, сенсорную реактивность к раздражителям различного типа (например, слуховые, визуальные и проприоцептивные раздражители) [34], [35], [36], оценку силы схвата [37] и двигательной активности [38] можно проводить, по выбору, до начала исследования и в 3-месячный период после начала исследования, вплоть до 12 месяцев, а также по окончании исследования (если оно длится более 12 месяцев). Дополнительные сведения о возможных последующих процедурах приведены в списке литературы соответственно. Однако можно использовать и другие, не приведенные в списке процедуры.

Для химических веществ, где предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы через 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать иммунотоксическое воздействие, дальнейшие исследования этого результата могут, по желанию, проводиться по окончании исследования.

4.1.1 Масса тела, потребление пищи/воды

Все животные должны взвешиваться в начале эксперимента, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и питательности пищи следует производить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем, когда вещество вводится через питьевую воду. Необходимо также учитывать потребление воды для исследований, в которых активность потребления воды изменяется.

4.1.2 Гематология и клиническая биохимия

В исследованиях, при которых задействуются грызуны, гематологические исследования необходимо проводить всем исследуемым животным (10 самцам и 10 самкам каждой группы), на 3, 6 и 12 месяцы, а также при прекращении исследования (если оно длится более 12 месяцев). В случае с мышами могут потребоваться вспомогательные животные для того, чтобы проводить все необходимые гематологические исследования (см. пункт 19). В исследованиях с негрызунами, пробы будут браться у меньшего количества животных (например, 4 особи каждого пола каждой группы в случае с исследованием собак), во время промежуточного взятия проб и по окончании исследования, как описано для грызунов. Нет необходимости проводить измерения ни у грызунов, ни у не-грызунов в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на гематологические параметры. Пробы крови следует брать из указанных мест, например сердечная пункция или из ретро-глазной пазухи под анестезией.

Необходимо исследовать приведенный список параметров [39]: общая и дифференциальная лейкоцитарная формула, содержание эритроцитов, содержание тромбоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит (гематокритное число), среднее гематокритное число (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН), концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), протромбиновое время и время образования и активности тромбопластина. Другие гематологические параметры, таких как тельца Гейнца или другая атипичная морфология эритроцитов и метгемоглобина, могут быть измерены по мере необходимости в зависимости от токсичности вещества. В целом, в зависимости от наблюдаемого и/или ожидаемого эффекта от данного вещества должен использоваться гибкий подход. Если химические вещества оказывают влияние на кроветворительную систему, можно также измерить число ретикулярных клеток и сделать цитологию костного мозга, хотя они не обязательны для регулярного проведения.

Клинические биохимические измерения для исследований основного токсического воздействия на ткани и особенно влияние на почки и печень следует проводить на пробах крови, полученных от как минимум 10 самцов и 10 самок каждой группы за одинаковые временные интервалы, как предписано для гематологических исследований, всегда используя одних и тех же животных. В случае с мышами, могут потребоваться вспомогательные животные для того, чтобы провести все необходимые клинические биохимические исследования. В исследованиях с негрызунами, образцы будут браться у меньшего количества животных (например, 4 животных каждого пола в каждой группе при исследованиях собак), во время промежуточного взятия проб и по окончании исследования, как описано для грызунов. Нет необходимости проводить измерения в три месяца, ни у грызунов, ни у негрызунов, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на клинические биохимические параметры. Рекомендуется голодание для животных (за исключением мышей) вечером накануне забора крови. Необходимо исследовать приведенный список параметров [38]: глюкоза, моча (азот мочевины), креатинин, общий белок, альбумин, кальций, натрий, калий, общий холестерин, как минимум, два анализа на гепатоцеллюлярный анализ (аланин-аминотрансфераза, аспартат-аминотрансфераза, глютаминатдегидрогеназа, желчные кислоты) (39), и, как минимум, два анализа на гепатобилиарный анализ (щелочная фосфатаза, гамма-глутаминтрансфераза, 5'-нуклеотидаза, общий билирубин, желчные кислоты) [40]. Другие клинические химические показатели, такие как триглицерид натощак, специфические гормоны и холинэстераза могут быть измерены в случае необходимости в зависимости от токсичности вещества. В целом необходим гибкий подход в зависимости от наблюдаемого и/или ожидаемого воздействия каждого конкретного вещества.

________________

Для ряда измерений в сыворотке и плазме, особенно глюкозы, ночное голодание является предпочтительным. Основной причиной этого предпочтения является то, что увеличение изменчивости, которое неизбежно возникло бы без голодания, маскировало бы более слабовыраженные эффекты и усложнило бы интерпретацию. Однако следует отметить, что ночное голодание может влиять на общий обмен веществ животных и, в частности, в исследованиях питания, может нарушить ежедневное воздействие исследуемого вещества. Все животные должны осматриваться в одном и том же физиологическом состоянии и желательно запланировать детальный или неврологический осмотр на день, отличный от дня клинических биохимических проб.

Анализ мочи должен проводиться у всех исследуемых животных (10 самцов и 10 самок каждой группы) на образцах, собранных за одинаковые промежутки времени, как и в случае с гематологией и клинической химией. Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на мочу. В экспертные рекомендации по исследованию клинической патологии был включен следующий список параметров [27]: внешний вид, объем, осмотическая концентрация раствора или относительная плотность, рН, общий белок и глюкоза. Другие исследования включают кетон, уробилиноген, билирубин и скрытую кровь. Дополнительные исследования могут быть использованы при необходимости расширить изучение наблюдаемых воздействий.

Как правило, считается, что основные гематологические и клинические биохимические параметры необходимо определять до начала терапии при исследованиях собак, но нет необходимости их определять в исследованиях грызунов [39]. Однако, если исторические исходные данные (см. п.58) недостаточны, следует уделить внимание созданию таких данных.

4.1.3 Патология (макроскопическая аутопсия)

Все животные в исследовании, как правило, подвергаются полной, детальной макроскопической аутопсии, которая включает тщательное исследование наружной поверхности тела, всех отверстий, черепных, грудных и брюшных полостей и их содержимого. При этом мог быть сделан резерв (в группах для промежуточных умерщвлений или во вспомогательных группах) для измерений, ограниченных отдельными, важными показателями, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность (см. пункт 21). Этих животных не нужно подвергать аутопсии и дальнейшим процедурам, описанным в последующих пунктах. Индикаторные животные могут требовать аутопсии в каждом отдельном случае, на усмотрение руководителя исследования.

Значимые органы следует собрать у всех животных, исключая тех, которые упомянуты выше. Надпочечник, мозг, придатки яичка, сердце, почки, печень, яичники, селезенка, яички, щитовидная железа (оценив постфиксацию, с паращитовидной железой) и матка всех животных (кроме тех, что были найдены умершими и/или были промежуточно умерщвлены) должны быть отсечены, если необходимо, от прилегающих тканей и взвешены как можно быстрее после отсечения для предотвращения высыхания.     

Следующие ткани должны быть законсервированы в наиболее подходящем средстве фиксации в качестве образца ткани и для запланированного дальнейшего микроскопического исследования [41] (ткани в квадратных скобках являются необязательными):

В случае с парными органами, например почки, надпочечники, следует сохранять оба органа. Клинические и другие данные могут потребовать изучения дополнительных тканей. Любые другие органы, считающиеся на основе известных свойств исследуемого вещества, возможными органами-мишенями, также следует сохранить. В исследованиях, где используется дермальный способ введения, должны быть сохранены те же органы, что установлены в списке для перорального введения, а также необходимо сохранить образцы кожи с места нанесения. В ингаляторных исследованиях список сохраняемых и исследуемых тканей дыхательных путей должен следовать рекомендациям из TG 412 [9] и TG 413 [10]. Для других органов/тканей (и в дополнение к отдельно сохраняемым тканям из дыхательных путей) список органов, как он установлен для перорального введения, должен быть пересмотрен.

4.1.4 Гистопатология

Имеется руководство по наработанным методам в рамках токсикологических патологических исследований [41]. Минимальными гистопатологическими анализами должны быть:

- все ткани из группы с высокой дозой и контрольной группы;

- все ткани животных, умерших или умерщвленных в течение исследования;

- все ткани, имеющие макроскопические аномалии;