ГОСТ 32647-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности (Переиздание)

     3 Описание метода

3.1 Животные

3.1.1 Выбор видов

Данный стандарт охватывает главным образом оценку и анализ хронической токсичности и канцерогенности у грызунов (см. пункт 2). Использование негрызунов может рассматриваться, если имеющиеся данные позволяют предположить, что они являются более значимыми для прогнозирования воздействия на здоровье человека. Выбор вида должен быть обоснован. Предпочтительным видом грызунов являются крысы, хотя могут использоваться и другие виды, например, мыши. Хотя использование мышей в тестировании на канцерогенность может иметь ограниченное применение [25], [26], [27], по некоторым действующим нормативным документам все же требуется исследование канцерогенности на мышах. Крысы и мыши были выбраны в качестве экспериментальных моделей за их сравнительно короткую продолжительность жизни, широкое применение в фармакологических и токсикологических исследованиях, их восприимчивость к индукции новообразований и доступность этих хорошо исследованных видов. Вследствие этих качеств, имеется большое количество информации об их психологии и патологии. Разработка и проведение исследований хронической токсичности и канцерогенности на видах не-грызунов, когда это необходимо, должны быть основаны на принципах, содержащихся в этом стандарте, а также в ОЭСР TG 409: исследование токсичности повторной дозы, введенной перорально через 90 дней у негрызунов [7]. Дополнительная информация по выбору видов и рода содержится в Руководстве N 116 [8].

Следует использовать молодых здоровых половозрелых животных лабораторных видов. Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности следует проводить на животных того же рода и того же происхождения, что и животные, использовавшиеся в предварительных токсикологических исследованиях небольшой продолжительности, хотя, если известно, что животные этого вида и происхождения имеют проблемы в достижении общепринятых критериев выживаемости для долгосрочных исследований (см. Руководство N 116 [8]), следует рассмотреть использование рода животного, имеющего приемлемый уровень выживаемости для долгосрочного исследования. Женские особи должны быть нерожавшими и не беременны.

3.1.2 Условия содержания и кормления

Животные могут жить отдельно или содержаться в клетках небольшими группами одного пола. Отдельное проживание следует применять только если это научно обосновано [17], [18], [19]. Клетки надо размещать таким образом, чтобы свести к минимуму возможное влияние их местоположения. Температура в помещении с экспериментальными животными должна быть (22 ±3)°С. Хотя относительная влажность должна быть как минимум 30% и не должна превышать 70% (если только не проводится уборка помещения), оптимальная влажность составляет 50%-60%. Свет должен быть искусственным, с последовательностью 12 часов - свет, 12 часов - темнота. Для кормления могут использоваться традиционные лабораторные диеты с неограниченным количеством питьевой воды. Диета должна отвечать всем требованиям питания тестируемого вида. Содержание загрязняющих веществ, которые могут повлиять на результаты исследования, включая остатки пестицидов, стойкие органические загрязнители, фитоэстрогены, тяжелые металлы и микотоксины и т.д., должно быть по возможности минимизировано. Аналитические данные по питанию и уровню загрязняющих веществ в пище должны собираться периодически, как минимум, в начале исследования и когда меняется используемая партия, и их следует включать в заключительный отчет. Должны также предоставляться аналитические данные по питьевой воде, используемой в исследовании. На выбор пищи может влиять необходимость введения примеси и удовлетворение пищевых потребностей животных, когда исследуемое вещество вводится в диетический рацион.

3.1.3 Подготовка

Должны использоваться здоровые животные, которые прошли адаптацию в лабораторных условиях, как минимум, в течение 7 дней и над которыми прежде не ставились эксперименты. В случае с грызунами, введение доз следует начинать как можно раньше, после отлучения от матери и адаптации, желательно, до того как животным исполнится 8 недель. Тестируемые животные должны быть описаны по роду, виду, происхождению, полу, массе тела и возрасту. В начале исследования разница в массе подопытных животных должна быть минимальна и не превышать ±20% от средней массы всех животных, задействованных в исследовании, отдельно каждого пола. Животные должны быть случайным образом распределены на контрольную и экспериментальные группы. После распределения заметной разницы в средней массы тела между группами каждого пола быть не должно. Если же она имеется, следует, по возможности, повторить распределение. Каждое животное должно быть помечено индивидуальным идентификационным номером, и этот номер следует нанести на перманентной основе, с помощью татуировки, вживления микрочипа или другим подходящим способом.

3.2 Основное испытание

3.2.1 Количество и пол животных

Должны использоваться животные обоих полов. Следует использовать такое количество животных, чтобы была возможна статистическая и биологическая оценка. Для грызунов, каждая дозируемая группа (как это предусмотрено в пункте 22) и параллельная ей контрольная группа, предназначенные для канцерогенной фазы исследования, должны содержать не менее 50 животных каждого пола. В зависимости от цели исследования, можно увеличить статистическую значимость основных оценок, разместив животных неравномерно по разным уровням дозы, с более чем 50 животными в низкодозируемых группах, например для оценки канцерогенного потенциала в малых дозах. Однако следует признать, что умеренное повышение размера группы будет обеспечивать сравнительно небольшое увеличение статистической значимости исследования. Каждая дозируемая группа (как изложено в пункте 22) и параллельная ей контрольная группа, предназначенные для фазы хронической токсичности исследования, должны содержать не менее 10 животных каждого пола, если это грызуны. Следует отметить, что это число меньше, чем в исследовании хронической токсичности TG 452. Интерпретация данных от сокращенного количества животных в группе фазы хронической токсичности, однако, будет подкрепляться большим числом животных канцерогенной фазы исследования. В исследованиях с использованием мышей, дополнительные животные могут быть необходимы в каждой группе фазы хронической токсичности, чтобы провести все необходимые гематологические анализы. Более подробную информацию о статистических методах исследования и выборе уровня доз для максимальной статистической мощности можно найти в руководстве N 116 [8].

3.2.2 Резерв для промежуточных умерщвлений, вспомогательные группы и индикаторные животные

При исследовании можно сделать резерв для промежуточных умерщвлений, например в 6 месяцев, для получения данных о развитии токсикологических изменений и данных о механизме воздействия, если это научно обосновано. Когда такая информация уже имеется от предыдущих исследований токсичности повторной дозы, промежуточные умерщвления не могу считаться научно обоснованными. Животные, используемые в фазе исследования хронической токсичности, длящейся, как правило, 12 месяцев (пункт 34), предоставляют данные промежуточного умерщвления для канцерогенной фазы исследования, что позволяет сократить количества животных, используемых в целом.

Также в исследование в фазе хронической токсичности могут включаться вспомогательные группы для отслеживания обратимости любых токсикологических изменений, вызванных химическими веществами при исследовании. Они могут быть ограничены группой с самым высоким уровнем дозы в исследовании и контрольной группой. Если потребуется, в ходе исследования может быть добавлена группа индикаторных животных (обычно, по 5 особей каждого пола) для отслеживания стадии заболевания [31]. Дальнейшие указания по разработке исследования, включающего промежуточные умерщвления, вспомогательных и индикаторных животных, при сведении к минимуму количества животных, используемых в целом, содержатся в Руководстве N 116 [8].

Если вспомогательные животные и/или промежуточные умерщвления включены в схему исследования, количество животных, входящее в каждую из этих групп, как правило, составляет 10 животных каждого пола, а общее количество животных, включенных в исследование, должно быть увеличено на количество животных, которое должно быть умерщвлено до конца исследования. Промежуточное умерщвление и вспомогательные животные, как правило, проходят те же обследования, что и животные фазы хронической токсичности основного исследования, в том числе контроль массы тела, продуктов питания/потребления воды, измерения гематологической и клинической биохимии и исследования на патологию, хотя также может быть сделан резерв (в группе промежуточного умерщвления) для измерений, ограничивающихся конкретными, ключевыми параметрами, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность.

3.2.3 Группы доз и дозировка

Указания по всем аспектам выбора дозы и интервалов между дозами содержится в Руководстве N 116 [8]. Следует использовать, как минимум, три уровня доз и параллельный контроль, для хронической и канцерогенной фаз. Чаще всего уровни дозы основываются на результатах краткосрочных исследований повторной дозы или исследованиях обнаружения диапазона. Необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные по тестируемому или родственным тестируемому веществам.

В фазе исследования хронической токсичности полное исследование с использованием трех уровней доз не является необходимым, если можно предполагать, что тестирование на одной дозе, эквивалентной не менее 1000 мг/кг массы тела/сутки, вряд ли даст эффекты воздействия. Это предположение должно быть основано на информации из предварительных исследований и из оценки, что токсичность не предполагается, исходя из данных по структурно родственным веществам. Может применяться ограничение 1000 мг/кг массы тела/сутки за исключением тех случаев, когда воздействие на человека указывает на необходимость использования более высокого уровня дозы.

Если нет ограничений по физико-химической природе или биологическому воздействию исследуемого вещества, должна быть выбрана самая высокая доза для определения основных органов-мишеней и токсических эффектов. Однако следует избегать страданий, тяжелой токсичности, болей или смерти. Самый высокий уровень дозы следует выбрать для получения доказательств токсичности, как, например, о токсичности свидетельствуют невозможность набрать массу тела (примерно 10%). Однако в зависимости от целей исследования (см. пункт 6) верхняя доза ниже, чем доза, подтверждающая наличие токсичности, может быть выбрана, например, если доза вызывает токсическое действие, которое, тем не менее, слабо отражается на продолжительности жизни или масса тела.

Уровни доз и интервалы между дозами могут быть выбраны для установления дозозависимого эффекта и, в зависимости от механизма действия испытуемого вещества, NOAEL или других предполагаемых результатов исследования, например, BMD (см. пункт 27). Условия, которые должны быть приняты во внимание при установлении нижней дозы, включают: предполагаемый наклон кривой дозовой зависимости; дозы, при которых могут происходить важные изменения в метаболизме или механизме токсического действия, когда пороговая величина предполагается, или когда предполагается исходная точка для экстраполяции низкой дозы. При проведении комбинированного исследования канцерогенности/хронической токсичности основная цель заключается в получении информации об оценке рисков канцерогенности, а информация о хронической токсичности, как правило, является вторичной задачей. Это должно быть учтено при выборе доз и интервалов между дозами для исследования.

Избранная разница в уровне доз будет зависеть от целей исследования и параметров тестируемого вещества и не может быть прописана в этом стандарте. Но интервалы доз, отличающиеся в 2-4 раза, оптимальны для установления уровней более низких доз, а при использовании очень больших интервалов (например, диапазон примерно 6-10) между дозировками предпочтительно добавление четвертой тестируемой группы. В целом следует избегать использования диапазона выше 10, а его применение должно быть обосновано.

Как изложено далее в руководстве N 116 [8], вопросы, которые следует учитывать при выборе дозы, включают:

- знания или предположения о нелинейностях или точках перегиба в зависимости "доза-ответ";

- токсикокинетика, и диапазон доз, когда имеет место или отсутствует метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между внешними и внутренними дозами;

- признаки поражения, влияния или показатели воздействия на основные биологические процессы;

- основные (или предполагаемые) проявления механизма действия, такие как дозы, от которых начинает увеличиваться цитотокичность, нарушается гормональный уровень, подавляется гомеостатический механизм и т.д.;

- интервалы кривой "доза - эффект", где необходима чрезвычайно надежная оценка, например в пределах ожидаемых BMD (исходная точка для установления минимальной дозы) или предполагаемых пороговых величин;

- уровни анализа предполагаемого воздействия на организм человека, особенно в выборе средних и низких доз.

Контрольная группа не должна получать исследуемое вещество или может получать, если она используется при введении тестируемого вещества. За исключением введения исследуемого вещества, с животными из контрольной группы следует обращаться тем же способом, что и с экспериментальными группами. Если используется среда, контрольная группа должна получать ее в максимальном объеме от используемого в экспериментальных группах. Если исследуемое вещество вводится с пищей и тем самым заметно снижает потребление пищи из-за снижения ее вкусовых качеств, будет полезна контрольная, получающая такое же питание и служащая для более адекватного контроля.