ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот

     А.4 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе диоксида кремния

    А.4.1 Основной метод на основе диоксида кремния

А.4.1.1 Общие положения

Настоящий метод пригоден для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. примеры в А.4.1.8). Этот метод также может применяться как метод дополнительной очистки растворов ДНК, полученных после выделения ДНК другими методами.

Метод адаптирован к опубликованной процедуре [28]. В случае пригодности метода к ДНК какого-либо продукта он имеет определенные преимущества, состоящие в том, что позволяет избегать использования очень токсичных реактивов. Кроме того, по причине отсутствия неустойчивых поверхностей раздела фаз (например, вода - хлороформ) и необходимости центрифугирования с низкой скоростью метод может быть легко адаптирован для выполнения ручных анализов высокой производительности и их автоматизации.

Настоящий метод не рекомендуется для выделения ДНК из продуктов с высоким содержанием жира.

А.4.1.2 Статус валидации

Этот метод прошел внутрилабораторную проверку и используется для систематических анализов во многих лабораториях. Метод не подвергался оценке путем официальных межлабораторных исследований. Принцип этого метода положен в основу множества созданных наборов и тест-систем для экстракции ДНК (см. [29]-[31]).

А.4.1.3 Принцип

Метод состоит из стадии лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия в буферном растворе) и последующей стадии очистки с помощью смол из диоксида кремния в присутствии разобщающего агента, вызывающего диссоциацию комплексов, гуанидина гидрохлорида. Принцип метода состоит в связывании нуклеиновых кислот диоксидом кремния при низкой водной активности в результате энтропийного эффекта [32]. Загрязняющие примеси вымывают из смолы изопропанолом, в то время как ДНК остается прикрепленной к адсорбенту. Во время заключительной стадии элюирования буферным раствором с низким содержанием соли извлекается ДНК.

А.4.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.4.1.5 Реактивы

А.4.1.5.1 Хлорид натрия, NaCI.

А.4.1.5.2 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.4.1.5.3 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (), .

А.4.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.4.1.5.5 Гидроксид натрия, NaOH.

А.4.1.5.6 Додецилсульфат натрия (SDS), .

А.4.1.5.7 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.4.1.5.8 Гуанидин гидрохлорид, .

А.4.1.5.9 Хлорид калия, KCI.

А.4.1.5.10 Гидроортофосфат натрия, .

А.4.1.5.11 Дигидроортофосфат калия, .

А.4.1.5.12 Изопропанол [].

А.4.1.5.13 Диоксид кремния (), диоксид кремния с гранулометрическим составом от 0,5 до 10 мкм (80% частиц от 1 до 5 мкм).

_______________

SIGMA S-5631 - пример подходящего коммерческого реактива. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этого реактива. Могут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.

А.4.1.5.14 Рибонуклеаза-А, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 100 ед./мг лиофилизата.

А.4.1.5.15 Раствор протеиназы-К, концентрацией 20 мг/см