Решение для управления процессами
производственной безопасности


ГОСТ Р ИСО 21571-2014

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Продукты пищевые

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ ПРОДУКТОВ

Экстракция нуклеиновых кислот

Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction



ОКС 67.050

ОКСТУ 9109

             9209

             9709

Дата введения 2015-07-01

     

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки "Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева" Российской академии наук (ИФР РАН) на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 ноября 2014 г. N 1656-ст.

4 Настоящий стандарт является идентичным международному стандарту ИСО 21571:2005* "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот" (ISO 21571:2005 "Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction"), включая техническую поправку: Amd.1:2013.

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.


При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации и межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Введение


Исследование генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты выделяются из анализируемой пробы. Выделенные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены от возможных примесей в самом процессе выделения или после него. Следующими этапами являются: оценка количества выделенных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Указанные этапы подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах*:

_______________

* Таблицу соответствия национальных стандартов международным см. по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.     


- ИСО 21568 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб";

- ИСО 21569 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте";

- ИСО 21570 "Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте".

Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к упомянутым выше этапам, приведена в ИСО 24276 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения".

В 2013 г. в ИСО 21571:2005 была внесена техническая поправка N 1 (Amd.1:2013) в части уточнения условий экстракции ДНК и добавления нового подраздела А.5.2 (приложение А), касающегося применения гуанидин-хлороформного метода для соевого лецитина. В настоящем стандарте техническая поправка N 1 выделена на полях одиночной вертикальной чертой.

     1 Область применения


Настоящий стандарт устанавливает общие требования и специфические методы выделения, очистки и количественной оценки дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК). Эти методы изложены в приложениях А и В.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, но может быть также применен к другим продуктам, например семенам и кормам.

Настоящий стандарт следует применять совместно с ИСО 21569, ИСО 21570 в части аналитических методов на основе нуклеиновых кислот, в частности качественных аналитических методов, установленных в ИСО 21569, и количественных аналитических методов, установленных в ИСО 21570.

     2 Нормативные ссылки


Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта.

ИСО 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения (ISO 24276:2006, Foodstuffs. Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. General requirements and definitions)

ИСО 21568:2003 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор образцов (ISO 21658:2003, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling)

     3 Принципы

     3.1 Общие положения


Основная цель применения методов экстракции нуклеиновых кислот - обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ИСО 24276).

Примечание - "Качество" ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами, гемином и т.д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1]-[4]).


Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.

     3.2 Экстракция ДНК


Основной принцип выделения присутствующей в пробе ДНК заключается в одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Методы выделения и очистки ДНК изложены в приложении А. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров продуктов, которые указаны в каждом методе.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте, подлежащем исследованию.

     3.3 Количественная оценка содержания ДНК


Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего ПЦР-анализа.

Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения при специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, биолюминесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для продуктов сложного состава, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.

Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении В.

Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от продукта, из которой была экстрагирована ДНК.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующем продукте.

     4 Общие требования к лаборатории


Вследствие воздействия пыли и распыляемых аэрозолей может происходить случайная контаминация ДНК, поэтому организация рабочих мест в лаборатории основывается на строгом соблюдении:

- последовательности всех установленных методологических этапов, используемых для получения промежуточных и конечных результатов;

- принципа "прямого потока" при обращении с пробами.

Использование последнего принципа гарантирует, что ДНК, подлежащая анализу, и полученная в результате ПЦР амплифицированная ДНК, остаются физически разделенными.

Дополнительные требования к лабораториям приведены в ИСО 24276.

     5 Методика

     5.1 Приготовление проб для анализа

5.1.1 Общие положения

Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, выделяемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от конкретного анализируемого продукта.

Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что проба для анализа является представительной, отобранной из лабораторной пробы.

Проба для анализа должна быть достаточной(го) массы (объема) и содержать достаточное количество молекул ДНК для обеспечения представительности лабораторной пробы.

Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы масса пробы для анализа превышала 2 г.

Любые ограничения, связанные с массой (объемом) пробы для анализа, не позволяющие рассматривать ее как представительную, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.

Методы экстракции ДНК, приведенные в приложении А, устанавливают массу пробы для анализа от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (молотое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная масса пробы не позволит выделить достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях масса (объем) пробы может быть увеличена.

Выделение ДНК должно выполняться не менее чем из двух параллельных проб одной и той же продукции.

Хранение стандартных образцов, лабораторных проб и анализируемых проб должно соответствовать требованиям ИСО 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ИСО/МЭК 17025).

5.1.2 Пробы

Все операции по приготовлению лабораторных проб (например, измельчение, гомогенизация, деление, высушивание) должны выполняться в соответствии с лабораторными правилами, описанными в ИСО 24276:2006 (пункт 5.3.2). При выполнении всех необходимых операций должны быть приняты меры предосторожности для защиты лабораторной пробы от загрязнения или изменения ее состава.

Лабораторные пробы должны быть достаточно гомогенными перед измельчением или размолом и перед отбором анализируемой пробы.


В случае жидких проб сосуд с пробой необходимо встряхивать для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.

В случае твердых проб, которые не могут быть суспендированы без затруднений, лабораторная проба должна быть размолота для уменьшения размера частиц и/или облегчения экстрагируемости ДНК. В таких случаях особое внимание необходимо обратить на размер частиц. Проба для анализа, подвергаемая экстракции, должна содержать минимальное количество частиц. Необходимо, чтобы оборудование, предназначенное для дробления и измельчения проб, было легко моющимся по всей рабочей поверхности и обеспечивало требуемое количество и распределение по размерам частиц (гранулометрический состав) анализируемой пробы.


Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстракции ДНК, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.

Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.

Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов в некоторых случаях можно использовать одну из следующих обработок:

- нагрев до максимальной температуры 40°С;

- растворение в соответствующей жидкости, например в воде;

- замораживание при температуре минус 20°С или ниже.

После такой обработки необходимо гомогенизировать всю лабораторную пробу. Затем необходимо отобрать две параллельные анализируемые пробы с учетом возможного проведения в дальнейшем процедур разбавления или концентрирования.


Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие нагрев лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество выделяемой ДНК.