МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов

5.2. Биохимические исследования фенотипических свойств штаммов

Исследования проводятся для подтверждения принадлежности к роду и дифференциации видов. Оптимальными для данной цели являются методы идентификации микроорганизмов с помощью биохимических диагностических тестпанелей одноразового пользования, отечественного и зарубежного производства, зарегистрированных в РФ в установленном порядке.

Для лактобактерий анализируется профиль ферментации расширенного набора углеводов и аминокислот (не менее 49 наименований).

Биохимическая идентификация бифидобактерий включает рутинную предварительную дифференциацию с определением их ферментативного профиля по укороченному спектру углеводов и многоатомных спиртов: лактоза, глюкоза, ксилоза, целлобиоза, рамноза, инулин, манноза, маннит, сорбит, инозит. С этой целью используют 1%-е растворы десяти вышеперечисленных углеводов, приготовленных на основе полужидкой питательной среды (пептон - 10 г, кукурузный экстракт - 30 мл, цистин солянокислый - 0,2 г, хлористый натрий - 2,0 г, агар-агар - 0,75 г на 1 л дистиллированной воды и соответствующего индикатора рН).

После проверки чистоты культуры с помощью микроскопии, с поверхности агаровой пластины снимают выросшие колонии петлей и ресуспендируют в стерильном растворе хлорида натрия для получения взвеси, содержащей 1 миллиард клеток бактерий в 1 мл по стандарту мутности (ОСО 42-28-59-85). Полученную взвесь бактерий в количестве 0,01 мл вносят в 1 мл основы (т.е. концентрация взвеси клеток в основе среды равна 10).

Растворы тестируемых углеводов и многоатомных спиртов вносят по 0,1 мл каждого в ряд лунок планшета для иммунологических исследований. В каждую из лунок затем добавляют по 0,1 мл взвеси испытуемой культуры бифидобактерий. В последнюю очередь в каждую лунку добавляют по 1 капле стерильного вазелинового масла. Для контроля среды в одну лунку помещают по 0,1 мл основы среды, по 0,1 мл взвеси испытуемой культуры и по 1 капле вазелинового масла. Для контроля жизнеспособности культуры во взвеси ее вносят в БС-среду.

Все посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч в анаэробных условиях, после чего осуществляют предварительный учет результатов; окончательно результаты учитывают через 48 ч.

Результаты учитывают по изменению окраски среды в лунках: положительный результат - желтое окрашивание, отрицательный - фиолетовое.

Детальное изучение биохимических свойств штаммов, показавших положительные реакции с соответствующими субстратами, изучают при использовании параллельно трех биохимических тест-систем:

а) типа API-20CHL (bioMerieux, Франция)

б) типа API-50CHL (bioMerieux, Франция)

б) типа АНАЭРОтест 23 (PLIDA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия)