ГОСТ Р 53761-2009 Молоко. Идентификация белкового состава электрофоретическим методом в полиакриламидном геле (Переиздание)
9 Проведение анализа
При сборке камеры для полимеризации геля используют стеклянные пластины размером: внутренняя - (200х200) мм и внешняя - (200х225) мм.
На внешнюю пластину справа и слева вдоль длинных сторон помещают спейсеры (пластинки) толщиной 1 мм. Поверх спейсеров накладывают внутреннюю стеклянную пластину. Пластины фиксируют зажимами справа и слева и устанавливают на подставку для заливки с желобом для выравнивания. Камеру проверяют на герметичность с помощью дистиллированной воды, которую затем удаляют. После проверки камеры на герметичность между пластинами камеры под небольшим углом помещают гребенку для формирования лунок.
Для обеспечения нормального процесса полимеризации геля раствор мономеров, приготовленный по 7.1.5, подвергают деаэрации в колбе с тубусом, присоединенной к водоструйному насосу. После деаэрации в раствор добавляют (0,0180±0,0003) г аммония надсернокислого и 0,018 см N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамина, осторожно перемешивают для предотвращения образования пузырей в растворе. Стеклянной пипеткой с грушей вдоль края спейсера (с приподнятой стороны гребенки) раствор вносят в камеру для полимеризации.
Гель полимеризуется в течение 45 мин, после чего гребенку извлекают и ополаскивают образовавшиеся в геле лунки дистиллированной водой.
Камеру с гелем прикрепляют к термостатируемой части и помещают в электрофоретическую ячейку.
В электродные камеры ячейки заливают электродный буфер, приготовленный по 7.1.6.
В лунки геля под электродный буфер с помощью микрошприца вносят контрольные и исследуемые растворы белков, приготовленные по 7.4. Крайние лунки геля рекомендуется использовать для контрольных растворов белков. Количество раствора, вносимого в одну лунку, составляет (0,020-0,025) см. После каждого внесения микрошприц тщательно промывают раствором электродного буфера.
Для получения достоверных результатов рекомендуется каждый исследуемый раствор белка вносить не менее чем в трех повторностях.
После внесения контрольных и исследуемых растворов электрофоретическую ячейку закрывают крышкой.
Электрофорез проводят в течениЕ (4-5) ч в режиме постоянного напряжения (120-130) В.
Примечание - Режим указан для электрофоретической ячейки с параметрами, указанными в 5, и полиакриламидного геля размером (160х160х1) мм. При использовании ячейки другого типа или геля с другими размерами режим проведения электрофореза подбирается индивидуально.
Для предотвращения неравномерного распределения тепла и искажения белковых зон (полос) рекомендуется обеспечить принудительное охлаждение термостатируемого резервуара.
Электрофорез считают законченным, когда лидирующий краситель опустится до нижнего края геля.
После проведения электрофореза гель аккуратно извлекают из электрофоретической ячейки, фиксируют и окрашивают. Фиксация и окраска осуществляются одновременно в растворе, приготовленном в соответствии с 7.1.7, в течение 2 ч. Для ускорения процесса допускается проводить окрашивание и фиксацию геля в течение одного часа на электроплитке при (40±5)°С, а ванночку с раствором и гелем необходимо регулярно покачивать.
Отмывку окрашенного геля производят кипячением в 10%-ном растворе уксусной кислоты до полного удаления фона с постоянной сменой отмывающего раствора по мере вымывания краски.
В приложении А приведены возможные причины отклонения от стандартного хода анализа и предложены способы их устранения.
Визуализацию разделения белков после электрофореза осуществляют с помощью фотоаппарата. Полученные электрофореграммы сохраняют на жестком магнитном носителе компьютера.