ГОСТ Р 52723-2007 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)
Приложение Б
(рекомендуемое)
Интерпретация результатов качественного определения
фрагментов видоспецифичной ДНК
Б.1 Использование метода электрофореза для детекции продуктов амплификации
В продуктах амплификации положительного контроля наборов для определения фрагментов видоспецифичной ДНК должна присутствовать одна яркая и четкая полоса - специфический фрагмент (см. рисунки Б.1 и Б.2). Размеры специфических фрагментов указаны в таблице Б.1.
М - маркер молекулярных масс; 1-3 - специфические фрагменты, являющиеся продуктами
амплификации К+: 1 - "LEC-ПЦР-ядро" (164 н.п); 2 - "ZEX-ПЦР-ядро" (273 н.п);
3 - "РАТЕХ-ПЦР-ядро" (300 н.п)
Рисунок Б.1 - Электрофореграмма фрагментов видоспецифичной ДНК сои, кукурузы и картофеля,
полученных при использовании наборов серии "ПЦР-ядро"
М - маркер молекулярных масс; 1-3 - специфические фрагменты, являющиеся продуктами
амплификации К+: 1 - "BOV-ПЦР-ядро" (274 н.п); 2 - "SUS-ПЦР-ядро" (398 н.п);
3 - "GUL-ПЦР-ядро" (431 н.п)
Рисунок Б.2 - Электрофореграмма фрагментов видоспецифичной ДНК говядины, свинины и курицы,
полученных при использовании наборов серии "ПЦР-ядро"
Таблица Б.1 - Продукты амплификации К+ из наборов реагентов серии "ПЦР-ядро"
Название набора | Предназначение | Размер ампликона (н.п.) |
LEC-ПЦР-ядро | Определение генома сои | 164 |
ZEX-ПЦР-ядро | Определение генома кукурузы | 273 |
РАТЕХ-ПЦР-ядро | Определение генома картофеля | 300 |
BOV-ПЦР-ядро | Определение генома крупного рогатого скота | 274 |
SUS-ПЦР-ядро | Определение генома свиньи | 398 |
GUL-ПЦР-ядро | Определение генома курицы | 431 |
В пробирке с К- любого из наборов для ПЦР не должны присутствовать как специфические, так и неспецифические фрагменты. Допускается присутствие неиспользованных в ходе ПЦР праймеров в виде слабо окрашенной нечеткой полосы размером менее 50 нуклеотидных пар (н.п.).
Положительными, то есть содержащими искомый фрагмент ДНК, считаются пробы, содержащие светящиеся полосы, расположенные на таком же расстоянии от точки старта, что и полоса соответствующего К+.
В случаях, когда в ходе детекции фрагмента ДНК какого-либо образца получен неоднозначный результат, для уточнения результата необходимо повторное проведение амплификации с анализируемым экстрактом ДНК. Если удовлетворительный результат не достигнут таким способом, требуется повторное выделение ДНК из новой пробы исследуемого материала и дополнительная постановка ПЦР.
Б.2 Использование детекции продуктов амплификации в реальном времени
В пробирке с К+ должно наблюдаться увеличение интенсивности флуоресценции (график имеет вид S-образной кривой). Подобная картина должна наблюдаться во всех положительных образцах (рисунок Б.3).
1 - точка начала log-фазы ПЦР и соответствующее ей количество выполненных циклов (32.32)
Рисунок Б.3 - Кривая флуоресценции накопленных продуктов ПЦР,
полученная в ходе ПЦР в реальном времени
В отрицательном контроле не должно происходить накопления продукта ПЦР, поэтому построенный прибором график должен иметь вид прямой линии. Подобная картина должна наблюдаться во всех отрицательных образцах (рисунок Б.4).
Рисунок Б.4 - Показания прибора при отсутствии накопления продуктов ПЦР
(отрицательный результат анализа)