ГОСТ Р 52723-2007 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)

     7 Амплификация фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных

Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных используют наборы реагентов для ПЦР, содержащие праймеры, специфичные к ДНК определенного вида растений или животных. При проведении анализа в ПЦР-лаборатории соблюдают меры предосторожности в соответствии с приложением А.

7.1 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных с использованием наборов реагентов для ПЦР с жидкими праймерами

7.1.1 В штативе размещают и маркируют необходимое число микропробирок с лиофильно высушенной амплификационной смесью по числу анализируемых проб, включая пробирки для положительного и отрицательного контролей. В случае исследования многокомпонентных продуктов число микропробирок на одну пробу, а также число микропробирок для отрицательных и положительных контрольных образцов рассчитывается исходя из того, какое число видов ДНК планируется идентифицировать.

7.1.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью при помощи автоматического дозатора последовательно вносят 10 мкл ПЦР-растворителя и 5 мкл смеси праймеров для выявления конкретного фрагмента видоспецифичной ДНК того или иного компонента растительного или животного происхождения. Перед использованием смесь праймеров необходимо разморозить в твердотельном термостате с охлаждением при температуре 4 °С, перемешать на микроцентрифуге-встряхивателе 5-10 с, а затем собрать осаждением на дно микропробирки путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе 3-5 с. Последующую работу с праймерами рекомендуется проводить при температуре от 2 °С до 4 °С с использованием твердотельного термостата с охлаждением.

7.1.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного контрольного образца вносят 5 мкл ТЕ-буфера, подготовленного по 6.2.12. Затем в микропробирки с ПЦР-смесью добавляют по 5 мкл экстракта ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь в микропробирку с ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+ из используемого набора реагентов для проведения ПЦР.

7.1.4 Содержимое микропробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-встряхивателе. После этого собирают осаждением капли ПЦР-смеси со стенок микропробирок путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 3-5 с.

7.1.5 Если для проведения амплификации используется амплификатор без нагреваемой крышки, то в каждую микропробирку добавляют по 20-25 мкл (2 капли) минерального масла.

7.1.6 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют 5-7 с на микроцентрифуге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения амплификации по программам, указанным в таблицах 1 и 2. По окончании действия программы пробирки извлекают из амплификатора и в штативе передают на этап детекции продуктов ПЦР.

Таблица 1 - Программа амплификации фрагментов видоспецифичной растительной ДНК (сои, кукурузы, картофеля)

Таблица 2 - Программа амплификации фрагментов видоспецифичной ДНК животных (крупного рогатого скота, свиньи, курицы)

7.2 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных с использованием наборов реагентов для ПЦР с высушенными праймерами

7.2.1 В зависимости от количества анализируемых проб в штативе размещают и маркируют микропробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью, одну микропробирку с лиофильно высушенной амплификационной смесью К-, одну микропробирку с лиофильно высушенным содержимым К+. В случае исследования многокомпонентных продуктов число микропробирок на одну пробу, а также число микропробирок для отрицательных и положительных контролей рассчитывают исходя из того, какое число видов ДНК планируется идентифицировать.

7.2.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью при помощи автоматического дозатора вносят 10 мкл ПЦР-растворителя.

7.2.3 В микропробирку К- вносят 10 мкл ТЕ-буфера, подготовленного по 6.2.12. В микропробирки с ПЦР-смесью добавляют по 10 мкл экстракта ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь в микропробирку К+ вносят 10 мкл ТЕ-буфера, подготовленного по 6.2.12. Содержимое микропробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-встряхивателе. После этого капли ПЦР-смеси собирают осаждением со стенок микропробирок путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 3-5 с.

7.2.4 Если для проведения амплификации используется амплификатор без нагреваемой крышки, то в каждую микропробирку добавляют по 20-25 мкл (2 капли) минерального масла.

7.2.5 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют 5-7 с на микроцентрифуге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения ПЦР по программам, указанным в таблицах 1 и 2. По окончании действия программы микропробирки извлекают из амплификатора и в штативе передают на этап детекции продуктов ПЦР.

7.3 Качественное определение фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных с использованием наборов реагентов для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени

7.3.1 В штативе размещают и маркируют необходимое количество микропробирок с лиофильно высушенной амплификационной смесью (для ПЦР в реальном времени) по количеству анализируемых проб, а также микропробирки для К- и К+. В случае исследования многокомпонентных продуктов число микропробирок на одну пробу, а также число микропробирок для К- и К+ рассчитывают исходя из того, какое число видов ДНК планируется идентифицировать.

7.3.2 В каждую микропробирку с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) при помощи автоматического дозатора последовательно вносят и 10 мкл ПЦР-растворителя и 10 мкл смеси праймеров для выявления конкретного фрагмента видоспецифичной ДНК того или иного компонента растительного или животного происхождения. Перед использованием смесь праймеров размораживают в твердотельном термостате с охлаждением при температуре 4 °С, перемешивают на микроцентрифуге-встряхивателе 5-10 с, а затем собирают осаждением на дно микропробирки путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе 3-5 с. Последующую работу с праймерами рекомендуется проводить при температуре от 2 °С до 4 °С с использованием твердотельного термостата с охлаждением.

7.3.3 В микропробирку с ПЦР-смесью для К- вносят 5 мкл ТЕ-буфера, подготовленного по 6.2.12. Затем в микропробирки с ПЦР-смесью (для ПЦР в реальном времени) добавляют по 5 мкл экстракта ДНК каждого из исследуемых образцов, подготовленных по разделу 6. В последнюю очередь в микропробирку с ПЦР-смесью для положительного контрольного образца вносят 5 мкл К+, который входит в состав набора реагентов. Содержимое пробирок растворяют путем легкого перемешивания на микроцентрифуге-встряхивателе. После этого собирают осаждением капли ПЦР-смеси со стенок пробирок путем центрифугирования на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 3-5 с.

7.3.4 Если конструкция используемой модели амплификатора требует проведения ПЦР в специальных пробирках-контейнерах, то полученное после растворения и перемешивания содержимое пробирок для амплификации полностью переносят в такие контейнеры.

7.3.5 Плотно закрытые микропробирки центрифугируют 5-7 с на микроцентрифуге-встряхивателе при 2000 об/мин и помещают в амплификатор для проведения амплификации по программам, указанным в таблицах 3 и 4.