ГОСТ Р 52723-2007 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)

     8 Детекция (обнаружение) продуктов амплификации

8.1 Детекция продуктов амплификации фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных методом электрофореза*

________________

* Детекцию данным методом проводят в случае анализа по 7.1, 7.2.

8.1.1 Детекцию продуктов амплификации проводят при помощи метода электрофореза в агарозном геле, реагенты для проведения которого собраны в специальный набор [18].

8.1.2 Содержимое пакета с надписью "Буфер для электрофореза" полностью переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см, растворяют в 600-800 см дистиллированной воды и доводят объем полученного раствора до 1000 см дистиллированной водой. Буфер хранят в течение года при комнатной температуре.

8.1.3 Подготовку к работе прибора для горизонтального электрофореза проводят в соответствии с прилагаемым к нему техническим описанием.

8.1.3.1 Размещают прибор на столе и с помощью регулируемых по высоте ножек, ориентируясь по уровням, устанавливают прибор в фиксированное, строго горизонтальное положение.

8.1.3.2 Собирают кювету для заливки геля и устанавливают в нее 1-4 гребенки (в зависимости от количества анализируемых проб) так, чтобы расстояние между зубцами соседних гребенок и одной из стенок кюветы составляло не менее 2 см.

8.1.4 Содержимое одного из пакетов с надписью "Агароза" полностью переносят в коническую термостойкую стеклянную колбу вместимостью 250 см, добавляют 150 см готового раствора буфера по 8.1.2 (концентрация геля - 1,5%). Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в СВЧ-печи (при средней мощности), периодически помешивая, и продолжают нагревать до совершенно прозрачного состояния (1 мин).

8.1.5 Агарозу охлаждают до температуры от 55 °С до 60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромистого этидия, аккуратно перемешивают, а затем наливают в кювету для геля прибора для электрофореза, не допуская образования воздушных пузырьков, так, чтобы толщина геля была не менее 5 мм, а зубцы гребенок были погружены в него не менее чем на 4 мм.

8.1.6 После полного застывания геля (15-20 мин) из геля осторожно извлекают гребенки так, чтобы не повредить образовавшиеся карманы. Кювету с готовым агарозным гелем переносят в электрофорезную камеру прибора.

8.1.7 В камеру для электрофореза заливают готовый раствор буфера для электрофореза так, чтобы жидкость покрывала гелевую пластину слоем 2-3 мм.

8.1.8 Отбирают 10 мкл продуктов ПЦР и осторожно вносят в карман гелевой пластины. При этом следует соблюдать следующий порядок внесения проб: сначала - содержимое пробирки с К-, затем - исследуемые пробы в строго фиксированной последовательности, и в последнюю очередь - содержимое пробирки с К+. Электрофорез проводят при напряжении 100-150 В в течение 20-30 мин, при этом красящий компонент ПЦР-смеси голубого цвета должен продвинуться не менее чем на 1 см от старта.

8.1.9 По окончании электрофореза гель помещают на фильтр трансиллюминатора системы для документирования гелей и проводят учет полученных результатов в ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм. Регистрацию и документирование полученных результатов путем занесения в базу данных компьютера осуществляют при помощи системы для документирования гелей в соответствии с прилагаемым к ней техническим описанием. Особенности интерпретации результатов качественного определения фрагментов видоспецифичной ДНК приведены в приложении Б (см. Б.1).

8.2 Детекция продуктов амплификации фрагментов видоспецифичной ДНК растений и животных в режиме реального времени*

_______________

* Детекцию данным методом проводят в случае анализа по 7.3, 7.4.

8.2.1 В ходе проведения ПЦР с детекцией продукта в реальном времени амплификатор с помощью программного обеспечения проводит построение кривых флуоресценции накопленных продуктов ПЦР. Данные кривые выражают зависимость флуоресценции от количества проведенных циклов амплификации (рисунок Б.3 приложения Б). При этом прибор автоматически определяет точку начала log-фазы, выраженную в количестве выполненных циклов. Эта точка характеризует исходное количество ДНК-матрицы в реакционной смеси.

8.2.2 Качественное определение видоспецифичной ДНК растений и животных проводят по наличию или отсутствию в реакционной смеси определенного фрагмента (продукта ПЦР), точно характеризующего тот или иной вид растения или животного. Выявление данного продукта происходит за счет встраивания в него интеркалирующего красителя SYBR Green.

8.2.3 Результаты качественного анализа отображаются с помощью программного обеспечения прибора в виде табличных данных. Особенности интерпретации результатов качественного определения фрагментов видоспецифичной ДНК приведены в приложении Б (см. Б.2).