МУ 3.3.2.2124-06

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.3.2. МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям
 для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза

     
Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" (И.А.Дятлов, И.В.Шульгина, Т.Н.Донская, О.П.Плотников, Г.Ю.Куляш, А.К.Никифоров); Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (Л.В.Саяпина, Т.И.Анисимова); Ростовским научно-исследовательским противочумным институтом (Л.С.Подосинникова, Г.Д.Харабаджахян, Н.Р.Телесманич, А.Б.Мазрухо); Иркутским научно-исследовательским противочумным институтом (Э.С.Каретникова, О.Г.Татарникова).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 11.07.06).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17 августа 2006 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона" (утв. ГУКИ МЗ СССР 02.02.83), "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для чумного микроба" (утв. ГУКИ МЗ СССР 07.09.83), "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для туляремийного микроба" (утв. в Иркутском НИ противочумном институте Сибири и Дальнего Востока 08.10.82).

1. Область применения

Методические указания по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям предназначены для контроля питательных сред лабораторного и промышленного изготовления, используемых при диагностике особо опасных инфекций (ООИ), по биологическим показателям.

Настоящими методическими указаниями необходимо руководствоваться бактериологам лабораторий противочумных учреждений, отделов особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, специализированных лабораторий учреждений здравоохранения.

2. Нормативные ссылки

2.1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2. Медицинские иммунобиологические препараты. Основные термины и положения: РД 42-28-24-88*.

________________

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

2.3. Положение о государственной регистрации сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации: Постановление ГК СЭН от 03.07.94 N 5*.

________________

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

2.4. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности: СП 1.3.1285-03.

2.5. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.

2.6. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.

2.7. Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.561-96.

3. Общие положения

3.1. Питательные среды по своему назначению подразделяются на диагностические и среды для выращивания биомассы при производстве различных медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

3.2. Диагностические среды включают: среды накопительные и для культивирования; для выделения конкретного возбудителя (элективные и селективные); дифференциальные (содержащие индикаторы, красители и т.д.); для идентификации, позволяющие по отдельным признакам (отношение к углеводам, мочевине, подвижности и т.п.) проводить идентификацию микроорганизмов.

3.3. Исследования по контролю качества питательных сред организуют и проводят в соответствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 и СП 1.2.731-99.

4. Биологические показатели, применяемые для оценки питательных сред

4.1. Чувствительность определяют по максимальному разведению культуры, при котором на всех засеянных чашках (пробирках) наблюдается рост. По этому показателю оценивают диагностические среды для выделения и дифференциальные.

4.2. Показатель прорастания - по проценту выросших колоний микроорганизмов от числа засеянных клеток. По этому показателю оценивают питательные среды для культивирования.

4.3. Эффективность - по выходу микробных клеток с 1 мл питательной среды. По этому показателю контролируют питательные среды для культивирования и среды, используемые в производстве МИБП.

4.4. Показатель стабильности основных свойств микроорганизмов при выращивании на испытуемой среде - по отношению числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим свойствам колоний к числу выросших на агаровых пластинках колоний тест-штаммов. Определяют для всех сред.

4.5. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных видовых и других признаков микроорганизмов определяют для сред дифференциальных и идентификации.

4.6. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору; выражается количеством микробов-ассоциантов, которое не растет на среде или числом сформировавшихся колоний микробов-ассоциантов, не препятствующих выделению возбудителя. Контролируют среды для выделения, дифференциальные и для накопления.

4.7. Показатель скорости роста - по минимальному времени вырастания культуры, для диагностических сред.

5. Организация проведения контроля

Для лабораторной диагностики возбудителей особо опасных инфекций используют питательные среды, имеющие сертификат производства и лицензию на производство, хранение и распространение, или среды, приготовленные по рецептуре, изложенной в методических руководствах и нормативных документах.

5.1. Качество питательных сред проверяют противочумные учреждения, применяя тест-штаммы I-IV групп патогенности, предусмотренные для контроля конкретных питательных сред. Лаборатории отделов особо опасных инфекций проводят контроль питательных сред с использованием тест-штаммов III-IV групп патогенности.

5.2. Для лицензированных питательных сред бактериологическому контролю подлежит первая варка и по одной варке ежегодно от каждой серии, а также все варки серии при изменении условий ее хранения или приготовления.

5.3. Для нелицензированных питательных сред, приготовленных по утвержденной рецептуре, контролируют каждую варку.

5.4. На контроль направляют по 200 мл плотных и по 100 мл жидких питательных сред. На этикетке указывают предприятие-изготовитель, название питательной среды, номер серии, дату приготовления, срок годности. Упаковка должна исключать возможность боя посуды и загрязнение среды при транспортировании.

5.5. Ингибиторы (теллурит калия, генцианвиолет и др.), среды с ингибиторами и стимуляторами роста (гемолизированная кровь и др.) проверяют противочумные учреждения.

5.6. Препаратами сравнения (контроль) должны быть ранее проверенные качественные питательные среды (аналоги по назначению).

5.7. Срок годности готовых питательных сред определен в нормативной документации и инструкциях по применению каждой конкретной среды.

6. Проведение контроля и оценка качества питательных сред

     
6.1. Контроль питательных сред для выделения, культивирования
 и идентификации возбудителя чумы

6.1.1. Тест-штаммы

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для культивирования и выделения возбудителя чумы, используют штаммы Yersinia pestis EV, Yersinia pestis P-1680 - Закавказского горного очага и Yersinia pestis И-2377 - Горно-Алтайского очага.

В качестве тест-штамма при контроле ингибиторов посторонней микрофлоры используют Escherichia coli 18, Bacillus cereus 8 и Proteus vulgaris HX 19 N 222. Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А.Тарасовича через Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб".

При бактериологическом контроле сред для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признаку ферментации мочевины и углеводов (ЦДС) используют тест-штаммы Yersinia pestis EV и Yersinia pseudotuberculosis И-199, который получают из Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

6.1.2. Порядок, хранения тест-штаммов

Тест-штаммы Y. pestis EV, Y. pestis P-1680, Y. pestis И-2377, E. coli 18, P. vulgaris НХ19 N 222, В. cereus 8 и Y. pseudotuberculosis И-199 хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5±1) °С до сохранения их свойств согласно п.6.1.3. Рабочие субкультуры хранят в 0,4%-м агаре Хоттингера рН 7,2±0,1 (по МУК 4.1/4.2.588-96, с.46) под слоем стерильного вазелинового масла или на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2±0,1 в запаянных пробирках при температуре (5±1) °С.

Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

6.1.3. Требования к тест-штаммам

Тест-штаммы Y. pestis EV, Р-1680 и И-2377 должны обладать типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, лизироваться чумным бактериофагом Л-413С. По морфологии - должны быть грамотрицательными палочками, на агаре образовывать колонии R-формы, в бульоне - рыхлый осадок с прозрачной надосадочной жидкостью. Биохимические свойства - должны ферментировать глюкозу, маннит и мальтозу, штамм Y. pestis EV не должен разлагать глицерин и рамнозу; штаммы Р-1680 и И-2377 должны ферментировать рамнозу и глицерин. Штамм Y. pestis EV при температуре выращивания (28±1) °С нуждается в аминокислотах - фенилаланине, метионине, треонине и цистеине; Y. pestis И-2377 - в фенилаланине, цистеине, аргинине и лейцине; Y. pestis Р-1680 - в фенилаланине, метионине и тиамине (витамин В). При работе с тиаминзависимыми штаммами Р-1680 Закавказского горного очага в питательные среды следует добавлять витамин В (0,0001 мг на 100 мл среды) или среду 199 (3 мл на 100 мл среды).

Тест-штамм Y. pseudotuberculosis И-199 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, лизироваться псевдотуберкулезным бактериофагом. На агаровых средах при температуре (28±1) °С тест-штамм псевдотуберкулезного микроба растет в виде бугристых хромогенных колоний, в бульоне - равномерное помутнение; в мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм должен ферментировать глюкозу, арабинозу, маннит, рамнозу, мочевину; не должен расщеплять лактозу, сахарозу; должен обладать подвижностью.

Тест-штамм Р. vulgaris НХ 19 N 222 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. В бульоне через 18-24 ч роста при температуре (37±1) °С - равномерное помутнение с пленкой на поверхности, на агаровых средах - в виде мутных сероватых роящихся колоний. В мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм Р. vulgaris должен ферментировать с образованием кислоты и газа глюкозу, маннозу, сахарозу и не расщеплять маннит и арабинозу.

6.1.4. Подготовка тест-штаммов

Культуры каждого тест-штамма из ампулы или со среды хранения пересевают в пробирку с бульоном Хоттингера рН 7,2±0,1 (МУК 4.1/4.2.588-96, с.45) и на чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2±0,1. Посевы с Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 инкубируют при температуре (28±1) °С в течение (48±1) ч; посевы с Е. coli 18, Р. vulgaris HX19 N 222 и В. cereus 8 - при температуре (36±1) °С в течение (24±1) ч. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяют визуально на чистоту роста и пересевают на скошенный в пробирках питательный агар. В случае отсутствия роста на питательной среде для последующего пассажа используют культуру, выращенную на питательном бульоне. После инкубации посевов Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 при температуре (28±1) °С и Е. coli 18, Р. vulgaris HX19 N 222 и В. cereus 8 - при температуре (36±1) °С в течение (24±1) ч, культуры используют для контроля питательных сред.

Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов не более 3-4 пассажей на питательных средах.

Из суточных агаровых культур тест-штаммов готовят взвесь в 0,9%-м растворе натрия хлорида рН 7,1±0,1 концентрацией 1х10 м.к./мл Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и P. vulgaris по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича ОСО 42-28-85П 10 единиц и делают 10-кратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида до разведения 10(1х10 м.к./мл), тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после переноса квоты каждого разведения.

6.1.5. Определение показателя прорастания и чувствительности плотных
и жидких питательных сред и скорости роста на них возбудителя чумы

Контроль жидких сред. Культуру из разведении 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл) вносят по 0,1 мл в 3 пробирки с 10 мл жидкой питательной среды. Контролем служит заранее отконтролированный бульон.

Контроль плотных сред. Культуру из разведения 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл) наносят по 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и хорошо подсушенные агаровые пластинки. Взвесь распределяют по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Контролем должен служить заранее отконтролированный агар.

Учет результатов. Учет результатов проводят через 24 и 48 ч инкубации при температуре (28±1) °С. Жидкие питательные среды считают пригодными для использования в диагностических целях, если через 24 ч в бульоне появляется видимый рост культуры, а через 48 ч - интенсивный рост чумного микроба во всех пробирках при высеве 1х10 м.к. на 10 мл среды (разведение 10) и в одной из пробирок при посеве 1х10 м.к. на 10 мл среды (разведение 10).

Плотные питательные среды должны обеспечивать рост чумного микроба через 48 ч инкубации на всех агаровых пластинках при высеве 10 м.к., показатель прорастания при высеве 100 м.к. должен быть не менее 50%. Начальный рост чумного микроба ("кружевные платочки") должен быть через 24 ч инкубации; типичные колонии диаметром не менее 1 мм - через 48 ч. Морфология микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки.

6.1.6. Определение показателя эффективности

Плотные питательные среды. Готовят взвесь Y. pestis EV из суточной агаровой культуры с концентрацией 5х10 м.к./мл, эквивалентную 5 единицам стандартного образца мутности ОСО 42-28-85П. По 0,1 мл этой взвеси засевают на 2 пробирки с 5 мл скошенного испытуемого агара (в нижней части пробирки не должно быть столбика). Через 48 ч инкубации при температуре (28±1) °С культуру смывают с поверхности агара 2,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. К 0,5 мл полученной взвеси мерно добавляют 0,9%-й раствор натрия хлорида до концентрации 1х10 м.к./мл, эквивалентной 10 единицам ОСО 42-28-85П. Например, на 0,5 мл взвеси, смытой со скошенного агара, пошло 3,2 мл растворителя; всего в пробирке будет 0,5 мл + 3,2 мл=3,7 мл. Выход с 1 мл среды - 3,7х10 м.к.

Жидкие питательные среды. Из суточной агаровой культуры Y. pestis EV готовят взвесь из разведений 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл). По 1 мл взвеси из каждого разведения вносят в 3 пробирки с 10 мл жидкой испытуемой среды. Исходное число засеянных клеток чумного микроба в 1 мл среды будет составлять соответственно 1х10 и 1х10 м.к. Параллельно делают высев по 0,1 мл взвеси из разведения 10 на 3 агаровые пластинки в чашках Петри для определения числа жизнеспособных клеток в посевной дозе (). Через 48 ч инкубации посевов при температуре (28±1) °С из каждой пробирки производят высев по 0,1 мл на чашки с питательным агаром (). В случае обильного роста культуры в жидкой среде ее перед высевом на чашки разводят. Степень разведения учитывают при обсчете результатов. Прирост () числа микроорганизмов после инкубации посевов проводят по формуле (%):