ГОСТ Р 51939-2002

Группа Н19

     

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

     

МОЛОКО

Метод определения лактулозы

Milk. Method for determination of lactulose content

ОКС 67.100.10

ОКСТУ 9209

Дата введения 2003-10-01

     

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Московским государственным университетом пищевых производств

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 25 сентября 2002 года N 347-ст

3 Настоящий стандарт за исключением разделов 2, 6, 7 и пунктов 3.2, 5.1-5.10, 5 и 6, 8.8.1-8.8.3 представляет собой аутентичный текст национального стандарта ФРГ ДИН 10461-90 "Молоко. Определение лактулозы"

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 2009 г.

     1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и устанавливает метод определения лактулозы. Стандарт применяется для идентификации пастеризованного, стерилизованного молока, молока, полученного ультравысокотемпературной (УВТ) обработкой.

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 245-76 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4174-77 Реактивы. Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4207-75 Реактивы. Калий железистосинеродистый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4523-77 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 10929-76 Реактивы. Водорода пероксид. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

_______________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.     

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

     3 Определение, обозначения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

массовая доля лактулозы в молоке: Массовая доля лактулозы, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в граммах на 100 г пробы.

3.2 В настоящем стандарте применяют следующие обозначения и сокращения:

НАДФ - -никотинамидадениндинуклеотидфосфат;

НАДФН - -никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленная форма;

ГЗ - -галактозидаза;

ГОД - глюкозооксидаза;

АТФ - аденозин-5'-трифосфат;

АДФ - аденозин-5'-дифосфат;

Г-6-Ф - глюкозо-6-фосфат;

Ф-6-Ф - фруктозо-6-фосфат;

ГК - гексокиназа;

Г6Ф-ДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;

ФГИ - фосфоглюкозоизомераза;

КАТ - каталаза;

Е - международная единица, определяющая количество (активность) фермента, который служит катализатором для превращения 1 мкмоля вещества в минуту при 25 °С.

     4 Сущность метода

4.1 Сущность метода

Метод основан на гидролизе лактулозы и лактозы [1], содержащихся в освобожденном от жира и белка водном экстракте пробы молока, в присутствии ГЗ с образованием моносахаров - галактозы, глюкозы и фруктозы; преобразовании фруктозы под действием НАДФ в присутствии ГК, ФГИ и Г6Ф-ДГ и фотометрическом измерении массовой доли образовавшегося НАДФН, эквивалентного массовой доле фруктозы, и расчете содержания лактулозы по разности оптических плотностей раствора пробы, в которой лактулоза подвергнута гидролизу, и раствора пробы, используемого при определении свободной фруктозы.        

 лактулоза +галактоза + фруктоза                                               (1)

     
лактоза + галактоза + глюкоза                                               (2)

В связи с тем, что в молоке содержится значительно больше лактозы чем лактулозы (массовые концентрации лактулозы в молоке приведены в приложении А), избыток глюкозы, образующейся при гидролизе лактозы, окисляют кислородом воздуха в присутствии ГОД и КАТ.     

  глюкоза + + глюконовая кислота +                                   (3)

    2 2+                                        (4)

Неокисленную глюкозу, а также фруктозу, образовавшуюся в ходе гидролиза лактулозы, подвергают фосфорилированию под действием АТФ в присутствии ГК.

глюкоза + АТФГ-6-Ф + АДФ                                              (5)

фруктоза + АТФФ-6-Ф + АДФ                                            (6)

Образовавшийся Г-6-Ф под действием НАДФ в присутствии Г6Ф-ДГ окисляют до глюконат-6-фосфата. Количество восстановленной формы НАДФН измеряют по величине оптической плотности при длинах волн 334, 340 или 365 нм.

Г-6-Ф + НАДФ +глюконат-6-фосфат + НАДФН + Н                                    (7)

Образовавшийся в ходе реакции (6) Ф-6-Ф после добавления ФГИ изомеризуется (8) в Г-6-Ф, который окисляется в ходе реакции (7). Массовую долю НАДФН, эквивалентную массовой доле фруктозы, измеряют по величине оптической плотности при длинах волн 334, 340 или 365 нм.

    Ф-6-ФГ-6-Ф                                                                   (8)

Для предотвращения влияния свободной фруктозы, которая может находиться в исследуемой пробе, при проведении контрольного определения не проводят гидролиз лактулозы с помощью ГЗ. Массовую долю лактулозы рассчитывают по разности оптических плотностей раствора пробы и контрольного раствора.

     5 Реактивы

При проведении анализа используют реактивы х.ч. или ч.д.а.

Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной.

Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной по ГОСТ 6709 или деминерализованной.

Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов для определения лактулозы при условии соответствия их качества требованиям настоящего стандарта.

5.1 Раствор сернокислого цинка

30 г сернокислого цинка по ГОСТ 4174 () растворяют в 100 см дистиллированной воды.

5.2 Раствор гексациано-(II)-феррата калия

15 г гексациано-(II)-феррата калия () по ГОСТ 4207 растворяют в 100 см дистиллированной воды.

5.3 Буферный раствор А активной кислотностью 7,5 рН

4,80 г гидрофосфата натрия () по ГОСТ 4172, 0,86 г дигидрофосфата натрия () по ГОСТ 245 и 0,10 г сернокислого магния по ГОСТ 4523 растворяют в 80 см дистиллированной воды. Значение активной кислотности раствора доводят до 7,5 рН, добавляя раствор гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 молярной концентрации 1 моль/дм. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 см. Приготовленного количества буферного раствора А достаточно для 15 определений.

5.4 Буферный раствор Б активной кислотностью 7,6 рН

14,0 г триэтаноламингидрохлорида [1] и 0,25 г сернокислого магния по ГОСТ 4523 растворяют в 80 см дистиллированной воды. Активную кислотность раствора доводят до рН 7,6 добавляя раствор гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 молярной концентрации 1 моль/дм. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100,0 см. Приготовленного количества раствора достаточно для 60 определений.