ГОСТ Р ИСО 10993.16-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 16. Моделирование и исследование токсикокинетики продуктов деструкции и вымывания

     5.2 Руководство по специфическим методам исследований

5.2.1 Основные положения

Исследование планируют таким образом, чтобы получить информацию для оценки степени риска. Однако обычно нет необходимости в рассмотрении всех аспектов.

5.2.1.1 Исследования абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции проводят по отдельности, изучая один из перечисленных процессов, или одновременно.

5.2.1.2 Количество изучаемых кинетических параметров выбирают в зависимости от программы исследований. Среди них - скорость абсорбции, скорость выведения, , , , , период полувыведения, среднее время длительности пребывания, объем распределения и клиренс.

5.2.1.3 Кинетические параметры могут быть определены только для особых видов молекул, и, следовательно, используют специфичные методы испытаний, чувствительные к этим молекулам. Истинные кинетические параметры каждого вещества могут быть определены только при его внутривенном введении. Поэтому при необходимости в программу включают исследования с внутривенным введением, но с ограничением числа введений. Это позволяет определить количество поглощаемого вещества, что служит для коррекции вычислений при оценке параметров, полученных в других исследованиях.

5.2.1.4 Для определения кинетических параметров используют соответствующую кинетическую модель. Существуют специальные компьютерные программы для вычисления этих параметров. Программное обеспечение утверждают до его использования и подтверждают это документально. Предложения, вводящиеся в программу, и выбор кинетической модели также подтверждают документально.

5.2.2 Абсорбция

Процесс абсорбции зависит от пути введения исследуемого вещества, его физико-химического состояния и экстрагирующей жидкости. Его оценивают по концентрации данного вещества в крови, в сыворотке, в выделениях и в тканях организма. Также рассматривают необходимость проведения исследования биологической доступности этого вещества. Выбор требуемого метода исследования зависит от информации, которую нужно получить, возможности применения материала, меченного радиоизотопами, и используемого метода анализа. При исследовании кинетических параметров константа скорости процесса абсорбции может быть достоверно вычислена при условии, что в фазе абсорбции взято достаточное количество проб.

Примечание - Существуют методы in vitro, которые дают важную информацию о желудочно-кишечной и кожной абсорбции химических веществ.

5.2.3 Распределение

5.2.3.1 Для исследования процесса распределения, как правило, используют помеченное радиоизотопами вещество. Исследования могут быть:

- количественными, определяющими уровни вещества в срезах тканей;

- качественными, использующими общую ауторадиографию;

- полуколичественными, использующими струкцию по степеням ауторадиографических стандартов.

5.2.3.2 Обычно при изучении процесса распределения временем отбора проб является , т.е. 24 ч и 168 ч или более, в зависимости от выведения исследуемого вещества. Отбор проб в промежуточные интервалы времени производят, когда требуются дополнительные данные. Более частый отбор проб обычно выполняют в ранних фазах абсорбции и выведения. При этом берут как можно больше проб в течение фазы выведения (теоретически 3-4 периода полувыведения) для того, чтобы обеспечить более точное определение параметров.

Основным решающим фактором является чувствительность метода.

5.2.4 Метаболизм и экскреция

5.2.4.1 Клетки для содержания животных при изучении метаболизма должны позволять производить отдельный сбор мочи и фекалий на всех этапах исследования. При длительности исследований до 14 сут мочу и фекалии отбирают отдельно через 24 ч и потом - через каждые 24 ч до конца эксперимента. Иногда план исследований может предусматривать забой животных на промежуточных стадиях. Пробы могут быть отобраны раньше 24 ч, когда есть вероятность быстрого выведения исследуемого вещества или его метаболитов. При длительных исследованиях отбор проб в начальном периоде производят так же, как для кратковременных исследований. Соответственно пробы отбирают непрерывно в течение 24 ч через установленный интервал времени.

Примечание - Использование клеток для изучения метаболизма при длительных исследованиях может быть вредным для здоровья животных. Поэтому при продолжительном эксперименте представительные пробы, полученные через определенные интервалы времени, собирают, и эти результаты экстраполируются как при непрерывном отборе проб.

5.2.4.2 Трупы животных и их органы-мишени сохраняют для исследований, а кровь этих животных забирают для определения концентрации веществ в плазме и цельной крови. После отбора проб в момент забоя клетки для исследований метаболизма, моче- и калосборники моют специальными растворителями. Полученные смывы сливают и репрезентативную часть сохраняют для анализов.

5.2.4.3 Когда используют вещество, помеченное радиоизотопами (см. примечание ниже), расчетное восстановление исследуемого вещества в норме должно быть (100±10)%. Количество исследуемого вещества в каждой фракции анализируют с помощью установленных процедур для каждого меченного или не меченного радиоизотопами вещества в соответствующей среде. При использовании веществ, меченных радиоизотопами, проводят оценку как первичного вещества, так и метаболитов, если при этом не были использованы специальные методики. Если вещество, меченное радиоизотопами, не восстанавливается в достаточном количестве в экскрете (фекалиях и/или моче) или в организме подопытного животного, рассматривают необходимость сбора выдыхаемого воздуха.

Примечание - Не во всех случаях достижима требуемая степень восстановления. Причины любых отклонений регистрируют и обосновывают в отчете об исследованиях.

5.2.4.4 Уровни радиоактивности в биологической среде определяют подсчетом, например методом сцинтилляции жидкости. Однако следует подчеркнуть, что в данном методе используется смешанная концентрация вещества и его метаболитов, поэтому на ее основе не могут быть определены кинетические параметры. Там, где необходимо отделение метаболитов, используют ряд процедур экстракции и хроматографических методов анализа (например, методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, хроматографии в тонком слое сорбента - тонкослойной хроматографии, газожидкостной хроматографии), а полученный материал характеризуют посредством ряда химических и физико-химических методов (например, масс-спектрометрический метод, спектроскопический метод ядерно-магнитного резонанса).

Примечание - Существует научная литература по применению культур тканей, клеток, гомогенатов и изолированных ферментов для изучения метаболизма в опытах in vitro. Эти методы позволяют прогнозировать пути метаболизма, что невозможно в методах in vivo, если вещество локализуется в недоступном для исследований месте. При сравнении бывают частые различия степени и скорости метаболизма в методах in vitro и in vivo.