ГОСТ 10444.7-86

Группа Н09

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

     

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

     
Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum

Food products. Methods for detection of botulinal toxins and Clostridium botulinum

МКС 07.100.30    

ОКСТУ 9109

Дата введения 1987-07-01

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 12 мая 1986 г. N 1214 дата введения установлена 01.07.87

ВЗАМЕН ГОСТ 10444.7-75, ГОСТ 10444.8-75

ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

Настоящий стандарт устанавливает методы выявления в пищевых продуктах ботулинических токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штаммов Clostridium botulinum, определения титра ботулинических токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур токсигенных штаммов С. botulinum типа А, В, С, D, Е, F и G.

Метод выявления ботулинического токсина и определение его титра основан на выявлении симптомов клинической картины болезни и гибели животных, характерных для ботулинической интоксикации.

Серологическое типирование токсина С. botulinum осуществляется на белых мышах путем постановки защитного теста in vivo или реакции нейтрализации in vitro с диагностическими противоботулинистическими типоспецифическими антитоксическими сыворотками.

Метод выявления С. botulinum основан на его способности развиваться и образовывать ботулинические токсины в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.

Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum из продукта или культуральной жидкости проводят путем высева на твердые питательные среды с последующим исследованием культуральных и морфологических признаков, характерных для С. botulinum, и определением способности выделенной культуры образовывать ботулинический токсин.

Методы предназначены:

для исследования продуктов по санитарно-эпидемиологическим показаниям;

для анализа посевов продуктов, в случае обнаружения в них мезофильных анаэробных микроорганизмов.

Исследования проводят в лабораториях, указанных органами здравоохранения.

Термины, применяемые в настоящем стандарте, и пояснения к ним приведены в приложении 1.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 5211-65.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Методы отбора проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668-85 и в соответствии с требованием приложения 4. Пробы пищевых продуктов подготавливают к анализу по ГОСТ 26669-85. Консервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18-70 и термостатируют по ГОСТ 26669-85.

1.2. Термостатированию не подлежат: консервы и полуконсервы в негерметичной таре, бомбажные, хлопуши, консервы с видимыми невооруженным глазом признаками развития микроорганизмов и предназначенные для одновременного выявления ботулинических токсинов и С. botulinum или только ботулинических токсинов.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ

2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы и растворы по ГОСТ 10444.1-84, а также аппаратуру, материалы, реактивы и растворы, указанные ниже:

анаэростат;

аппарат для встряхивания;

баллоны с газами (азот, водород, гелий или смесью: азот 80%, углекислый газ - 10%, водород - 10%);

весы аналитические;

грушу резиновую;

доски для сушки посуды;

ерши для мойки посуды;

корзинки проволочные луженые для стерилизации;

микроскоп биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования;

микропипетки;

пестик для фарфоровой ступки;

петли бактериологические;

пипетки пастеровские;

пробирки центрифужные вместимостью 10-100 см;

размельчитель тканей лабораторный;

редукторы к баллонам с газом;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

фильтры асбестовые, керамические, мембранные;

флаконы вместимостью 100-500 см;

футляры металлические для стерилизации пипеток, чашек Петри, шприцев;

штативы для пипеток;

штативы для пробирок;

бумагу индикаторную;

дуршлаг;

масло иммерсионное;

перчатки резиновые;

фильтр тканевый;

мышей белых массой 15-20 г одного пола;

бриллиантовый зеленый, раствор: 0,5-1,0 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см этилового спирта. Применяют для метки белых мышей;

кальций углекислый стерильный готовят по ГОСТ 10444.1-84. Добавление углекислого кальция к средам с глюкозой способствует образованию спор С. botulinum;

кислоту аскорбиновую, раствор массовой концентрацией 50 г/дм: 5 г аскорбиновой кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят объем дистиллированной водой до метки, растворяют и стерилизуют фильтрованием, используя фильтры со средним диаметром пор 0,40-0,45 мкм. Раствор следует применять свежеприготовленным. Допускается использовать без стерилизации раствор аскорбиновой кислоты для инъекций. Применяют в качестве восстановителя, связывающего кислород в питательных средах для С. botulinum;

кислоту молочную, -форма по ГОСТ 490-2006;

кислоту пикриновую, раствор: 2,5 пикриновой кислоты растворяют в 100 см воды при нагревании. Применяют для метки белых мышей;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, раствор с массовой долей соляной кислоты 4%. Применяют для подкисления питательных сред;

масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78 или подсолнечное по ГОСТ 1129-93*; масло вазелиновое разливают в колбы по 20-50 см и стерилизуют горячим воздухом в стерилизаторе в течение 60 мин при температуре 140 °С; масло подсолнечное прокаливают при температуре (160±1) °С горячим воздухом в стерилизаторе в течение 2 ч, охлаждают, фасуют в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 30 мин;

________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52465-2005.

мальтозу;

малахитовый зеленый;

медь сернокислую по ГОСТ 4165-78, 1%-ный раствор. Применяют для постановки биуретовой реакции в питательных средах;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор с массовой долей гидроокиси натрия 4%. Применяют для подщелачивания питательных сред;

натрий углекислый по ГОСТ 83-79, 0,3-1%-ный раствор. Применяют для кипячения игл для шприцев (см. приложение 3);

натрия тиогликолят;

неомицин;

перекись водорода по ГОСТ 177-88, раствор с массовой долей перекиси водорода 3%;

растворы фосфатного буфера:

для приготовления фосфатного буфера готовят растворы:

А - раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (KНРО - квалификации х.ч., дважды перекристаллизованный или для рН-метрии) массовой концентрацией 9,078 г/дм;

Б - раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (NaHPO·2HO квалификации х.ч., дважды перекристаллизованный) массовой концентрацией 11,876 г/дм;

для приготовления 100 см фосфатного буфера:

pH 6,0 - к 12 см раствора Б добавляют 88 см раствора А;

рН 6,2 - к 18,5 см раствора Б добавляют 81,5 см раствора А;

рН 6,8 - к 50 см раствора Б добавляют 50 см раствора А;

раствор фосфатного буфера рН 6,0 применяют для растворения трипсина;

растворы желатино-фосфатного буфера:

в 100 см фосфатного буферного раствора с определенным значением рН вносят 0,6 г желатина, дают набухнуть желатину и нагревают до полного растворения желатина. Стерилизуют при температуре (110±1) °С в течение 15 мин;

раствор желатино-фосфатного буфера рН 6,2 применяют в качестве стабилизатора ботулинических токсинов. В случае выявления ботулинического токсина типа А переходят на раствор желатино-фосфатного буфера рН 6,8;

смесь реактивов для создания анаэробных условий готовят по ГОСТ 10444.1-84. Допускается использование талька вместо инфузорной земли;

трипсин, раствор: 1,5 г трипсина растворяют в 100 см раствора фосфатного буфера рН 6,0. Раствор трипсина стерилизуют фильтрованием через керамический или мембранный фильтр с размерами пор 0,40-0,45 мкм или другой эквивалентный фильтр. Стерильный раствор трипсина вносят в регенерированную и охлажденную питательную среду асептически непосредственно перед использованием из расчета 1 см раствора трипсина на 15 см среды. Применяют для активизации протоксина С. botulinum;