ГОСТ EN 1528-4-2014 Продукты пищевые с большим содержанием жира. Определение пестицидов и полихлорированных бифенилов (ПХБ). Часть 4. Определение, методы подтверждения, прочие положения

     5 Методы подтверждения [1]

5.1 Общие положения

При проведении анализов в рамках официального надзора особенно важно, чтобы методы подтверждения проводились до отрицательных результатов о пробах, содержащих остатки пестицидов, которые обычно не встречаются в данной пробе, или о случаях превышения максимальных количеств. Иногда происходит загрязнение проб химическими веществами, которые не являются пестицидами и при применении некоторых хроматографических методов ведут себя аналогичным образом, и поэтому эти составляющие могут обладать свойствами, характерными для пестицидов, и вследствие этого ошибочно идентифицированы как пестициды. Таким примером из газовой хроматографии являются сигналы эфиров фталевой кислоты (фталатов) при использовании ДЭЗ и серосодержащих веществ при применении фосфорселективных детекторов.

Различают два типа методов подтверждения: количественный метод важен тогда, когда содержание пестицидов превышает максимальные количества, тогда как качественное подтверждение идентичности также требуется в этих случаях, а также если вещества оказываются нетипичными. К качественным методам относятся химические реакции или разделения, при которых пропадает некоторая доля веществ. Особые проблемы при подтверждении появляются в случаях, когда максимальные количества находятся в области границ определения.

Необходимость подтверждения может зависеть от типа пробы или от сведений о ней. Для многих веществ определенные остатки обнаруживаются почти всегда. В серии проб аналогичного происхождения может быть достаточным для подтверждения идентичности остатков только в первой пробе. Если известно, что материал пробы содержит данный пестицид, подтверждать идентичность может быть необязательно, однако подтверждение необходимо для отдельных случайно выбранных проб. При наличии контрольных проб их следует использовать для проверки присутствия сопутствующих веществ.

Для количественного подтверждения следует применять как минимум одну альтернативную процедуру и указывать меньшую измеренную величину. Для качественного подтверждения рекомендуется применять альтернативный метод, который основывается на других физико-химических свойствах.

Необходимые для положительной идентификации действия проводятся по усмотрению аналитика, и особое значение при этом придается выбору такого метода, который исключает влияние сопутствующих веществ. Выбор метода будет зависеть от оснащенности лаборатории приборами и от проводимых в ней опытов.

В качестве руководства для аналитика в 5.2-5.9 приведен ряд альтернативных процедур подтверждения.

5.2 Альтернативные колонки для газовой хроматографии

Результаты, полученные при проведении первичного анализа, должны подтверждаться количественно и качественно с использованием как минимум одной альтернативной колонки, содержащей стационарную фазу другой полярности. Количественные результаты не должны отличаться от результатов первичного анализа более чем на 20%, и в отчете указывается меньшее значение, так как более высокое может быть получено в результате влияния совместно экстрагируемых сопутствующих веществ. Последующее количественное подтверждение требуется, когда результаты различаются более чем на 20%, за исключением случаев, когда максимальное количество соответствует приблизительно границам определения, когда приемлемым будет отклонение до 100%.

При выборе материала альтернативной колонки следует обратить внимание на то, чтобы вещество было отделено от остатков пестицидов и ПХБ или сопутствующих веществ, которые на первой колонке имеют те же значения времени удерживания, как и выявленный остаток. Альтернативная колонка может быть набивной колонкой или, что является более предпочтительным, капиллярной колонкой из-за ее более высокой скорости разделения. Хотя альтернативная ГХ-колонка не всегда позволяет добиться положительного подтверждения, она может опровергнуть сомнительную идентичность. В каждом случае необходимо последующее подтверждение для идентификации остатка.

5.3 Альтернативные ГХ-детекторы

При присутствии пестицидов, содержащих несколько химических элементов, могут использоваться детекторы, которые избирательно определяют эти элементы. Пламенно-фотометрические детекторы (для серы, фосфора и олова), щелочные пламенно-ионизационные детекторы (для фтора и азота) или кулонометрические детекторы (для азота, серы и галогенов) могут давать ценную дополнительную информацию об остатках. Определяемое пламенно-фотометрическим детектором отношение серы к фосфору может дать необходимую информацию при исследовании фосфотиолатов.

5.4 Тонкослойная хроматография

В некоторых случаях результаты ГХ-анализа могут выгодно подтверждаться с помощью ТСХ. Идентификация основывается на двух критериях - значении Rf и реакции обнаружения. Научная литература содержит многочисленные ссылки на технику. В [2] опубликован обзор по технике и изложено внедрение. Однако для количественного определения ТСХ годится ограниченно. Применение ее может расширяться в тех случаях, когда в области значения Rf интересующего нас пестицида с пластины для ТСХ соскребается слой адсорбента, пестицид элюируют из слоя и раствор исследуют другими физическими или химическими методами подтверждения.

Стандартный раствор пестицида наносят рядом с очищенным экстрактом пробы, в результате чего не возникает никаких проблем из-за неповторяющихся значений Rf. Нанесение стандартного раствора и экстракта пробы на одно и то же стартовое пятно также может дать ценную информацию. Преимущества ТСХ - это высокая скорость, низкие затраты и возможность применения для термочувствительных веществ. Недостатки ТСХ заключаются в более низкой чувствительности по сравнению с газовой хроматографией и часто в необходимости более основательной очистки экстракта. В некоторых странах высокая влажность воздуха или высокая температура может приводить к худшей воспроизводимости.

5.5 Высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ часто может быть выгодным для подтверждения остатков, изначально выявленных с применением ГХ или других методов, и в некоторых случаях может оказаться предпочтительным методом количественного подтверждения. Получение производных до и после колонки и/или использование различных детекторов дают новые возможности для аналитика, особенно когда термочувствительность или низкая летучесть анализируемого вещества затрудняет исследование методом газовой хроматографии.

5.6 Фракционирование на колонке

Последовательность элюирования из хроматографической колонки во время очистки экстрактов пробы может способствовать подтверждению идентичности вещества. Таким образом, уже известное подтверждение может являться составной частью процедуры экстрагирования и очистки.

5.7 Получение производных
     

    5.7.1 Химические реакции

Часто используют химические реакции в микроколичествах, в результате которых образуются продукты разложения, продукты присоединения или конденсации пестицидов и которые затем снова исследуются хроматографически. Эти продукты имеют другие величины времени удерживания и/или величину отклика детектора, чем первоначальные, исходные пестициды. Параллельно с предполагаемым веществом проводят реакцию со стандартом пестицида, чтобы можно было непосредственно сравнить оба результата. Должен исследоваться также экстракт с добавкой пестицида, чтобы доказать, что реакция протекала в присутствии одновременно экстрагируемых сопутствующих веществ. Обзор химических реакций, которые применяются для целей подтверждения, приведен в [3]. Химические реакции имеют преимущество в том, что они могут проводиться быстро и легко, но в некоторых случаях для этого, возможно, потребуется закупить и/или очистить специальные реактивы.

5.7.2 Физические реакции

Целесообразным является использование фотохимического превращения остатка пестицида для получения одного или нескольких продуктов с воспроизводимым хроматографическим образцом [4]. Стандартный раствор пестицида и пополненный им раствор экстракта всегда должны обрабатываться одинаково. Результаты проб, содержащих остатки более чем одного пестицида, иногда трудно интерпретировать. В таких случаях вещество можно разделить перед реакцией с помощью ТСХ, ВЭЖХ или фракционированием на колонке.

5.7.3 Другие методы

Многие пестициды могут разлагаться или изменяться под действием ферментов. В отличие от обычных химических реакций эти процессы являются очень специфическими и в общем случае состоят из окисления, гидролиза или деалкилирования [3]. Продукты превращений обладают иными, чем исходный пестицид, хроматографическими характеристиками и могут использоваться для целей подтверждения, если они сравниваются с продуктами превращения с использованием стандартного раствора веществ.

5.8 Масс-спектрометрия

Применение масс-спектрометрии для подтверждения идентичности имеет самую высокую достоверность [6], [7]. При наличии оборудования масс-спектрометрия обычно выбирается как основной метод подтверждения. Существует два способа введения проб. Более предпочтительным способом является предварительное газохроматографическое разделение перед введением в масс-спектрометр. Это позволяет выполнить полный масс-спектрометрический анализ пика во время основного анализа. При применении альтернативного способа пробы вводятся напрямую. Этот способ работы позволяет комбинировать его с ТСХ и ВЭЖХ, если ранее они были применены для подтверждения. Отделенные с применением этих способов остатки выделяют и подвергают масс-спектрометрическому анализу. Чтобы повысить чувствительность, особенно для квадрупольных масс-спектрометрических детекторов, используют однократную и многократную регистрацию ионов. Выбирают достаточное количество факторов для обеспечения четкой идентификации. Повышенная чувствительность при регистрации молекулярного иона может достигаться за счет применения химической ионизации вместо ионизации электронным ударом. Так как масс-спектрометры работают в нанограммовом диапазоне, может возникнуть необходимость сконцентрировать некоторые экстракты после газовой хроматографии перед проведением масс-спектрометрического анализа, особенно если для количественного определения были использованы ДЭЗ. В некоторых случаях потребуется дополнительная очистка, особенно если должны быть сняты спектры в режиме полного ионного тока. При масс-спектрометрии могут возникнуть проблемы для термочувствительных соединений, и поэтому следует соблюдать особую осторожность при соединении газовых хроматографов с масс-спектрометрами, так как в масс-спектрометрии практически нет другого отклика для соединений при наличии совместно элюированных примесей.