В необходимое количество расплавленного и охлажденного питательного агара добавляют 5% фильтрованной через стерильную вату желчи, перемешивают, разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или автоклавируют при 0,5 атм. (110°C) в течение 30 минут.
Перед разливом в чашки Петри в каждый флакон с расплавленным и охлажденным до температуры 50°C желчным агаром добавляют 20% инактивированной в течение 30 минут лошадиной сыворотки.