ГОСТ 34533-2019 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (с Поправками, с Изменением № 1)
8 Порядок выполнения анализа
8.1 Условия хроматографического разделения
8.1.1 Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-спектрометрического детектирования и хроматографического разделения.
8.1.2 Например, для колонки длиной 150 мм с обращенно-фазовым сорбентом с частицами размером не более 5 мкм соблюдают следующие условия хроматографического анализа:
- температура колонки - 40°С;
- скорость потока подвижной фазы - 200 мм/мин;
- объем вводимой пробы - 20 мм.
8.1.3 Разделение проводят в режиме градиентного элюирования. В качестве подвижной фазы А используют деионизированную воду, в качестве подвижной фазы Б - метанол. Измерение каждой пробы проводят дважды: в режиме регистрации положительных ионов и в режиме регистрации отрицательных ионов.
При регистрации положительных ионов: в начальный момент по 0,5 мин - соотношение фаз А/Б по объему (90/10); с 0,5 по 20,0 мин - градиентное элюирование к 40% фазы Б; с 20,0 по 23,0 мин - соотношение фаз А/Б по объему (60/40); с 23,0 по 23,2 мин - переход к 100% фазы Б; с 23,2 по 25,0 - подаются 100% фазы Б; с 25,0 по 33,0 мин - уравновешивание колонки при соотношении фаз А/Б по объему (90/10).
При регистрации отрицательных ионов: в начальный момент до 0,5 мин - соотношение фаз А/Б по объему (75/25); с 0,5 по 4,0 мин - градиентное элюирование до 100% фазы Б; с 4,0 по 6,5 мин подаются 100% фазы Б; с 6,5 по 13 мин - уравновешивание колонки при соотношении фаз А/Б по объему (75/25).
Детектирование пиков проводят методом "регистрации множественных реакций" (MRM). Для каждого соединения измеряют сигнал для двух ионов согласно таблице 3.
Таблица 3 - Параметры воздействия на ионы в режиме MRM и условиях электроспрея с регистрацией положительных или отрицательных (-) ионов
Аналит | Ион-предшественник, m/z | Ион-продукт, m/z | Время удерживания, мин | |||
Нитроимидазолы | ||||||
Диметридазол | 142,1 | 81,1 | 96,1 | 9,5 | ||
Диметридазол- | 145,1 | 99,1 | 9,3 | |||
Ронидазол- | 204,1 | 143,1 | 6,5 | |||
Ронидазол | 201,1 | 140,1 | 110,1 | 6,9 | ||
Ипронидазол | 170,1 | 124,1 | 109,1 | 19,6 | ||
Ипронидазол- | 173,1 | 127,1 | 19,4 | |||
Гидроксиипронидазол | 186,1 | 168,1 | 122,1 | 15,6 | ||
Гидроксиипронидазол- | 189,1 | 171,1 | 15,3 | |||
Метронидазол | 172,1 | 128,1 | 82,1 | 7,3 | ||
Гидроксиметронидазол | 188,1 | 123,1 | 126,1 | 4,6 | ||
Метронидазол- | 175,1 | 131,1 | 7,0 | |||
Гидроксиметилметил- | 158,1 | 140,1 | 55,0 | 5,8 | ||
Гидроксиметилметил- | 161,1 | 143,1 | 5,5 | |||
Тернидазол | 186,1 | 128,1 | 82,1 | 11,3 | ||
Тинидазол | 248,1 | 121,1 | 93,0 | 10,5 | ||
Амфениколы | ||||||
Хлорамфеникол | -321,0 | 152,0 | 257,0 | 194,0 | 7,7 | |
Хлорамфеникол- | -326,1 | 157,0 | 7,7 | |||
Хлорамфеникол- | 328,1 | 280,1 | 20,5 | |||
Флорфеникол | -356,1 | 185,1 | 119,1 | 6,7 | ||
Флорфеникол амин | 248,1 | 230,1 | 130,1 | 1,7 | ||
Тиамфеникол | -353,9 | 290,0 | 184,9 | 4,3 | ||
Сульфаниламиды | ||||||
Сульфапиридин | 250,1 | 184,1 | 156,1 | 10,0 | ||
Сульфадиазин | 251,1 | 156,1 | 108,1 | 7,1 | ||
Сульфадиазин- | 255,1 | 160,1 | 6,7 | |||
Сульфатиазол | 256,1 | 156,1 | 108,1 | 9,0 | ||
Сульфатиазол- | 260,1 | 160,1 | 8,7 | |||
Сульфамеразин | 265,1 | 156,1 | 110,1 | 10,9 | ||
Сульфаметазин | 279,1 | 186,1 | 124,1 | 14,2 | ||
Сульфаметазин- | 283,1 | 186,1 | 13,9 | |||
Сульфахлорпиридазин | 285,1 | 156,1 | 15,8 | |||
287,1 | 156,1 | |||||
Сульфахиноксалин | 301,1 | 156,1 | 146,1 | 24,3 | ||
Сульфаэтоксипиридазин | 295,1 | 156,1 | 140,1 | 20,8 | ||
Сульфагуанидин | 215,1 | 156,1 | 60,1 | 2,8 | ||
Сульфаметоксазол | 254,1 | 156,1 | 108,1 | 16,3 | ||
Сульфаметоксазол- | 258,1 | 160,1 | 16,0 | |||
Сульфаметоксипиридазин | 281,1 | 156,1 | 108,1 | 14,9 | ||
Сульфамоксол | 268,1 | 156,1 | 113,1 | 13,6 | ||
Сульфаниламид | 173,1 | 156,1 | 92,1 | 3,0 | ||
Сульфадиметоксин | 311,1 | 156,1 | 245,1 | 23,2 | ||
Сульфадиметоксин- | 315,1 | 160,1 | 23,0 | |||
Триметоприм | 291,1 | 230,1 | 130,1 | 7,2 | ||
Триметоприм- | 300,1 | 230,1 | 6,7 | |||
Пенициллины | ||||||
Бензилпенициллин | -333,0 | 289,0 | 192,0 | 8,2 | ||
Бензилпенициллин- | -340,0 | 199,0 | 8,5 | |||
Бензилпенициллин- | 342,1 | 183,1 | 27,0 | |||
Феноксиметилпенициллин | -349,0 | 208,0 | 305,0 | 8,3 | ||
Ампициллин | 350,1 | 192,1 | 106,1 | 13,6 | ||
Оксациллин | -400,1 | 259,0 | 356,1 | 8,3 | ||
Амоксициллин | 366,1 | 114,1 | 208,0 | 3,4 | ||
Диклоксациллин | -468,0 | 424,1 | 327,0 | 8,5 | ||
Клоксациллин | -434,1 | 390,1 | 290,1 | 8,4 | ||
Нафциллин | -413,0 | 272,2 | 243,2 | 7,0 | ||
* Внутренние стандарты. | ||||||
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*Примечание - Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
8.1.4 Относительное отклонение времени удерживания в анализируемых пробах от градуировочных данных не должно превышать 2,5%.
8.2 Построение градуировочной характеристики
Построение и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов программным обеспечением хромато-масс-спектрометра.
8.2.1 Проводят измерения не менее четырех матричных градуировочных растворов, приготовленных по 6.2.2.5, в порядке возрастания их концентраций. Определяют времена удерживания ион-продуктов аналитов и их внутренних стандартов.
8.2.2 Вычисление площади пика проводят для каждого ион-продукта анализируемых аналитов и их внутренних стандартов. Количественное определение остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов проводят по одному (наиболее интенсивному) ион-продукту.
8.2.3 Градуировочную характеристику строят в координатах "отношение площади пика определяемого соединения к площади пика внутреннего стандарта этого соединения" - "отношение концентраций аналита и внутреннего стандарта". При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида y=a+bx, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98. Построение градуировочной характеристики проводят при каждой серии измерений заново.
Соответствие аналитов и их внутренних стандартов указано в таблице 1.
8.2.4 Построение линейного градуировочного графика и расчет концентраций аналитов в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.
8.3 ВЭЖХ-МС/МС измерение
8.3.1 Для измерения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов проводят ВЭЖХ-МС/МС анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования.
8.3.2 Анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы: