ГОСТ 32380-2013 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Испытания по оценке токсического воздействия на пренатальное развитие
5. Процедура испытания
5.1 Количество и пол животных
Каждая экспериментальная и контрольная группы должны содержать достаточное число женских особей для получения примерно 20 самок с имплантацией для аутопсии. Группы, состоящие из менее чем 16 животных с имплантацией, могут быть неприемлемы. Материнская смертность, не превышающая 10%, не влияет на результаты исследования.
5.2 Подготовка доз
При использовании растворителя или других добавок для облегчения дозирования необходимо уделять внимание следующим его характеристикам: влияние на поглощение, распределение, метаболизм и удержание/выведение исследуемого вещества; влияние на химические свойства исследуемого вещества, которые могут изменить его токсические свойства; влияние на потребление воды и пищи или режим питания животных. Растворитель не должен обладать репродуктивной токсичностью или токсичностью для развивающегося организма.
5.3 Дозирование
Как правило, исследуемое вещество необходимо вводить ежедневно после имплантации (на 5-й день после спаривания) до дня, предшествующего дню запланированного кесарева сечения. Если проведенные предварительные исследования не указывают на высокий потенциал предимплантационной гибели, исследование может быть продлено на весь период беременности, от спаривания до дня, предшествующего запланированному умерщвлению. Хорошо известно, что ненадлежащее обращение и стресс во время беременности могут привести к пренатальной потере (выкидышу). Поэтому следует избегать воздействия факторов, не связанных с экспериментом, таких как: ненадлежащее обращение с беременными животными, стрессы от внешних факторов, шум и др.
Необходимо использовать, как минимум, три уровня доз и параллельную контрольную группу. Здоровые животные должны быть произвольно распределены на экспериментальные и контрольные группы. Уровни доз должны выбираться с учетом возможности дальнейшей градации токсических эффектов. Если не ограничиваться физико-химическими или биологическими свойствами исследуемого вещества, наиболее высокая доза должна выбираться с целью индуцировать определенную токсичность для развивающегося организма и/или материнской особи (клинические признаки или снижение массы тела), но не смерть или тяжелые страдания. Как минимум, один промежуточный уровень дозы должен приводить к появлению минимальных наблюдаемых токсичных эффектов. Наименьший уровень дозы не должен приводить к появлению каких-либо признаков токсичности для развития плода или материнской особи. Убывающая последовательность доз должна быть выбрана так, чтобы продемонстрировать любое соотношение доза-ответ и уровень, при котором не наблюдаются негативные эффекты (NOAEL), или доз близких пределу обнаружения эффекта, которые позволяют определить критическую дозу. Двух/четырехкратные интервалы, как правило, являются оптимальным для установления убывающей последовательности доз, и добавление четвертой тестовой группы часто предпочтительнее использования очень больших интервалов (более чем 10-и кратных) между дозами. Несмотря на то, что получение NOAEL для материнской особи является целью испытания, исследования, в которых не определяется данный показатель, могут также быть приемлемы.
Уровни доз следует выбирать с учетом любых существующих данных о токсичности, а также дополнительной информации о метаболизме и токсикокинетике исследуемого вещества или близких к нему веществ. Подобная информация будет способствовать демонстрации соответствия режима дозирования.
В испытании необходимо использовать параллельную контрольную группу. Данная группа должна подвергаться фиктивному воздействию или воздействию растворителем, если растворитель используется для введения исследуемого вещества. Для всех групп должен использоваться одинаковый объем исследуемого вещества или растворителя. Животные из контрольной группы (групп) должны содержаться идентично животным из экспериментальных групп. Для контрольных групп, подвергающихся воздействию растворителя, необходимо использование самой высокой дозы растворителя (как для группы с наименьшей дозой исследуемого вещества).
5.4 Испытание с предельной дозой
Если испытание с одной дозой в 1000 мг/кг массы тела в день, вводимой перорально, с использованием представленных процедур, не приводит к появлению признаков токсичности и появления эффекта не ожидается согласно существующим данным (например, при исследовании структурно и/или метаболически родственных соединений), то полное исследование с использованием трех доз не является необходимым. Ожидаемое воздействие на организм человека может указывать на необходимость использования более высокого уровня пероральной дозы в испытании с предельной дозой. Для других способов введения дозы, таких как ингаляционный или дермальный, физико-химические свойства исследуемого вещества часто могут указывать на максимально достижимый уровень воздействия (например, дермальное нанесение не должно вызвать серьезные местные поражения).
5.5 Введение экспериментальной дозы
Исследуемое вещество или растворитель, как правило, вводят перорально посредством интубации. Если используется другой способ введения, необходимо представить обоснование и аргументировать выбор. Исследуемое вещество следует вводить каждый день примерно в одно и то же время.
Дозы для каждого животного выбираются на основании последнего индивидуального определения массы тела животного. Тем не менее, следует соблюдать осторожность при определении дозы в течение последнего триместра беременности. Для предотвращения появления избыточной токсичности для материнской особи при выборе дозы необходимо использовать существующие данные. Однако, если в ходе эксперимента отмечается чрезвычайно высокое токсическое воздействие на самок, их необходимо гуманно умертвить. Если несколько беременных животных проявляют признаки избыточной токсичности, следует рассмотреть возможность прекращения дозирования группы. При введении вещества через желудочный зонд дозирование необходимо проводить с использованием желудочной трубки или подходящей интубационной канюли в виде разовой дозы. Максимальный объем жидкости, которая может быть введена за один раз, зависит от размера экспериментального животного. Объем не должен превышать 1 мл на 100 г массы тела, за исключением водных растворов, когда можно использовать 2 мл на 100 г массы тела. Если в качестве растворителя используется кукурузное масло, объем не должен превышать 0,4 мл на 100 г массы тела. Изменения тестового объема должны быть сведены к минимуму путем регулирования концентрации для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз.
5.6 Обследование самок
Клинические наблюдения должны проводиться и регистрироваться, как минимум, один раз в день, предпочтительно в одно и то же время с учетом пикового периода ожидаемых эффектов после введения дозы. Состояние животных должно быть зарегистрировано, включая смертность, состояние агонии, соответствующие изменения в поведении и все признаки очевидной токсичности.
5.6.1 Масса тела и потребление пищи
Животных необходимо взвешивать в день 0 или не позднее дня 3, если оплодотворенные животные поставляются от стороннего производителя, в первый день воздействия, а затем каждые три дня в течение эксперимента и в день запланированного умерщвления.
Потребление пищи необходимо регистрировать с трехдневным интервалом, совпадающим с интервалом определения массы животных.
5.6.2 Обследование после вскрытия
Самки должны быть умерщвлены за один день до предполагаемых родов. Самок, у которых наблюдаются признаки выкидыша или признаки преждевременных родов до запланированного времени умерщвления, необходимо умертвить и подвергнуть тщательному макроскопическому обследованию.
В момент умерщвления или смерти во время исследования самки должны быть осмотрены макроскопически на наличие любых структурных аномалий или патологических изменений. Осмотр самок во время кесарева сечения и последующего анализа плода должен проводиться без информации о принадлежности к исследуемой группе в целях объективности.