ГОСТ 31789-2012 Рыба, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Количественное определение содержания биогенных аминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Переиздание)

     7 Проведение испытаний

7.1 Подготовка к испытанию

7.1.1 Очистка растворителей

Растворители перед анализом проверяют на наличие примесей, мешающих определению аминов, и, при необходимости, дополнительно очищают и перегоняют общепринятыми методами.

7.1.2 Приготовление исходных растворов

Готовят исходные растворы гистамина, кадаверина, путресцина, тирамина, спермина и спермидина, а также 1,7-диаминогептана (внутреннего стандарта) массовой концентрацией 1 мг/см. Для этого навеску 0,100 г индивидуального амина, взвешенную с точностью до третьего знака, количественно переносят в мерную колбу на 100 см и доводят до метки 0,2 М раствором соляной кислоты. При использовании гидрохлоридов аминов необходимо пересчитывать массу навески с учетом количества молекул гидрохлорида. Например, масса навесок гидрохлоридов аминов для приготовления 100 см раствора:

гистаминдигидрохлорид - 0,166 г;

путресциндигидрохлорид - 0,183 г;

кадавериндигидрохлорид - 0,171 г;

спермидинтригидрохлорид - 0,175 г;

сперминтетрагидрохлорид - 0,172 г;

тирамингидрохлорид - 0,126 г.

Примечание - Гидрохлориды биогенных аминов должны быть высушены в течение суток в эксикаторе над концентрированной серной кислотой.

7.1.3 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы готовят из стандартных растворов. Для этого в мерные колбы вместимостью 100 см отмеривают по 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 см каждого амина и доводят объем до метки 0,2М раствором соляной кислоты. Получают градуировочные растворы с массовой концентрацией по 0,005, 0,010, 0,025, 0,050 и 0,100 мг/см каждого амина.

7.1.4 Приготовление ацетатного буферного раствора

8,2 г ацетата натрия переносят в мерную колбу на 1000 см, добавляют 6 см уксусной кислоты и доводят до метки дистиллированной водой. Значение рН буферного раствора должно составлять 4,7+0,1. Регулируют рН 1М раствором гидроксида натрия или уксусной кислотой.

7.1.5 Приготовление раствора уксусной кислоты молярной концентрацией 0,02 моль/дм

1,2 г уксусной кислоты помещают в мерную колбу на 1000 см и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.1.6 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм

7,3 г соляной кислоты помещают в мерную колбу на 1000 см и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.1.7 Приготовление раствора 5-диметиламино-нафталинсульфонил-хлорида (дансилхлорида) концентрацией 5 мг/см

50,0 мг дансилхлорида взвешивают с точностью до десятых долей, помещают в колбу вместимостью 20-25 см и добавляют 10 см ацетона.

7.1.8 Подготовка колонки с Amberlite CG-50

2,0 г ионообменной смолы Amberlite CG-50 заливают 50 см ацетатного буферного раствора по 7.1.4 и выдерживают в течение 24 ч, после чего заполняют колонку и дают стечь элюату таким образом, чтобы над слоем сорбента оставалось не более 3 мм раствора, приливают 50 см раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм, дают стечь раствору, но не допускают высыхания колонки и приливают 100 см буферного раствора.

7.2 Проведение испытания

7.2.1 Выделение биогенных аминов из продукта

Навеску продукта массой 10 г помещают в колбу вместимостью 100 см, добавляют внутренний стандарт объемом 1 см и доводят до метки 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Затем гомогенизируют полученную суспензию в течение 1-2 мин со скоростью не менее 8000 об/мин. Полученную смесь фильтруют через складчатый фильтр.

7.2.2 Очистка фильтрата на колонке с ионообменной смолой Amberlite CG-50