ГОСТ 31708-2012 (ISO 7251:2005) Микробиология пищевых продуктов и кормов. Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli. Метод наиболее вероятного числа (с Поправкой)

     9 Проведение определения

9.1 Метод качественного определения

9.1.1 Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта согласно ГОСТ 26669, [3], [4], [5], [6] или [7].

Состав ЕС-бульона с лаурилсульфатом при определенной концентрации согласно таблице 1 а) и b).

Добавляют 1 см первичного разведения к 9 см бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации (0,1 г или 0,1 см образца) или 10 см первоначального разведения к 10 см бульона с лаурилсульфатом двойной концентрации (1 г или 1 см образца). Для больших объемов пробы первичное разведение приготавливают добавлением 0,1 см или 0,1 г к 9 см разбавителя ([3], [4] или [7]), затем добавляют весь объем первичного разведения к 90 см бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации. Например, добавляют 5 см или 5 г образца к 45 см разбавителя и весь объем начальной суспензии вносят в 450 см бульона с лаурилсульфатом одинарной концентрации или вносят пробу в равный объем.

9.1.2 Инкубация селективного обогатительного бульона (бульона с лаурилсульфатом)

Инокулированный бульон с лаурилсульфатом одинарной или двойной концентрации (см. 5.2) инкубируют в термостате (см. 6.2) при температуре 37 °С в течение (24±2) ч. Если на этой стадии не обнаруживают ни газообразования, ни замутнения среды, затрудняющего определение газообразования, продолжают инкубацию до (48±2) ч.

Примечание - Время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (48±2) ч.

При исследовании некоторых молочных продуктов (например, казеина) пробирки-поплавки Дарема могут застревать на дне пробирки с селективной обогатительной средой. Если после 48 ч инкубации в пробирке обнаруживают лишь помутнение без газообразования, то также осуществляют пересев в ЕС-бульон согласно 9.1.3.

9.1.3 Инокуляция и инкубация селективной среды (ЕС-бульона)

При обнаружении помутнения, выпадения осадка или видимого газообразования после инкубации (см. 9.1.2) селективной среды двойной концентрации или при обнаружении видимого газообразования после инкубации селективной среды одинарной концентрации с помощью бактериологической петли (см. 6.5) проводят пересев в пробирку с ЕС-бульоном. Инокулированный ЕС-бульон инкубируют на водяной бане (см. 6.3) или в термостате (см. 6.2) (24±2) ч при температуре 44 °С. Если на этой стадии не обнаруживают видимого газообразования в ЕС-бульоне (см. 5.3), то общее время инкубации продлевают до (48±2) ч.

Примечание - Общее время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (24±2) ч.

9.1.4 Инокуляция и инкубация пептонной воды

При обнаружении видимого газообразования после инкубации согласно 9.1.3 с помощью бактериологической петли (см. 6.5) производят пересев в пробирку с пептонной водой (см. 5.4), предварительно прогретой до температуры 44 °С. Инкубируют (48±2) ч при температуре 44 °С.

9.1.5 Обнаружение образования индола

В пробирку с пептонной водой (см. 5.4) после инкубации согласно 9.1.4 добавляют 0,5 см реактива на индол (см. 5.5). После интенсивного перемешивания через 1 мин проводят оценку реакции. Красное окрашивание в спиртовой фазе свидетельствует о наличии индола.

9.1.6 Оценка результатов

При обнаружении видимого газообразования в пробирке с ЕС-бульоном и образования индола в пробирке с пептонной водой (см. 9.1.2-9.1.4) селективную обогатительную среду оценивают как положительную (презумптивная Escherichia coli обнаружена).

9.2 Метод количественного определения

9.2.1 Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта по ГОСТ 26669.

Подготавливают достаточное число разведений, чтобы в максимальном разведении с уверенностью получить отрицательный результат.

9.2.2 Инокуляция и инкубация селективного обогатительного бульона (бульона с лаурилсульфатом)

9.2.2.1 Подготавливают ряд последовательных разведений, по три пробирки на каждое разведение. Для проб живых моллюсков и некоторых других особых продуктов, а также для получения большей точности результатов необходимо использовать по пять пробирок на каждое разведение (см. приложение А).

9.2.2.2 Берут три пробирки с селективной обогатительной средой двойной концентрации [см. таблицу 1 а)] и, используя стерильную пипетку (см. 6.7), в каждую пробирку вносят по 10 см первичного разведения. Таким образом, каждая пробирка этого ряда будет содержать по 1 г образца.

9.2.2.3 Берут три пробирки с селективной обогатительной средой одинарной концентрации [см. таблицу 1 b)] и, используя новую стерильную пипетку (см. 6.7), в каждую пробирку вносят по 1 см первичного разведения. Таким образом, каждая пробирка этого ряда будет содержать по 0,1 г образца.

9.2.2.4 Для каждого последующего разведения (соответствующего 0,01 г, 0,001 г и т.д. продукта на пробирку) повторяют процедуру, как в 9.2.2.3, используя для каждого разведения новую пипетку. Инокулят и среду тщательно перемешивают.

9.2.2.5 Инокулированные среды с лаурилсульфатом двойной по 9.2.2.1 или одинарной концентрации по 9.2.2.3 и 9.2.2.4 инкубируют в термостате (см. 6.2) при температуре 37 °С в течение (24±2) ч. Если на этой стадии не обнаруживают ни газообразования, ни замутнения среды, затрудняющего определение газообразования, продолжают инкубацию до (48±2) ч.

Примечание - Время инкубации проб живых моллюсков должно составлять (48±2) ч.

При исследовании некоторых молочных продуктов (например, казеина) пробирки-поплавки Дарема могут застревать на дне пробирки с селективной обогатительной средой. Если после 48 ч инкубации в пробирке обнаруживают лишь помутнение без газообразования, то также осуществляют пересев в ЕС-бульон согласно 9.2.3.

9.2.3 Инокуляция и инкубация селективной среды (ЕС-бульона)