ГОСТ 31959-2012 (ISO 14669:1999) Вода. Методы определения токсичности по выживаемости морских ракообразных

Приложение B
(обязательное)

Методы культивирования тест-организмов

B.1 Условия культивирования тест-организмов

B.1.1 Исходный материал для культивирования тест-организмов получают в лабораториях, занимающихся тестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности. Чувствительность культур к модельному токсиканту должна соответствовать установленному в настоящем стандарте диапазону за 48 ч (метод Б) или за 72 ч (метод A).
     

Тест-организмы культивируют и содержат в климатостате, в инкубаторе, на водяной бане или в помещении с регулируемой температурой (20±2) °С.

При этом обеспечивают естественное или искусственное освещение так, чтобы соблюдались следующие периоды выдержки: 16 ч - воздействие света при освещенности 500-1000 лк, 8 ч - без воздействия света (в темноте).

Nitocra spinipes Boeck и Tisbe battagliai Volkmann-Rocco необходимо защищать от воздействия прямого света. Acartia tonsa Dana может чувствовать себя лучше при освещенности среды с культурой тест-организмов до 2200 лк.

Тест-организмы и морская вода, в которой происходит их культивирование, должны содержаться в емкостях только из стекла или полимерного материала, изготовленного без использования пластификатора.

Примечания

1 Морские копеподы Acartia tonsa Dana, Tisbe battagliai Volkmann-Rocco и Nitocra spinipes Boeck имеют широкое географическое распространение, обладают коротким жизненным циклом и требуют минимум пространства и оборудования для культивирования и проведения тестирования. Организмы могут культивироваться постоянно в лабораторных условиях.

2 Развитие копепод (веслоногих раков) проходит через шесть науплиальных стадий и пять стадий копеподитов, после чего наступает взрослая стадия. При температуре 20 °С развитие только что вылупившихся науплиев до взрослой стадии проходит за 10-14 сут. Науплии выпускаются непосредственно из яйцевого мешка женской особью Tisbe battagliai Volkmann-Rocco и Nitocra spinipes Boeck в течение 3-4 сут, Acartia tonsa Dana выпускает яйца в течение 2-3 сут.

3 Приведенная в данном приложении информация предназначена для использования только в качестве общего руководства.

B.1.2 Вода для культивирования тест-организмов - по 4.2 и 5.2 (далее - морская вода) в зависимости от метода тестирования; при необходимости корректируют минерализацию (соленость) воды в соответствии с условиями тестирования.

B.1.3 Емкости, применяемые для культивирования тест-организмов, должны быть оснащены свободными или перфорированными крышками, чтобы уменьшить испарение, но обеспечить газообмен. Потеря морской воды из-за испарения должна возмещаться путем добавления дистиллированной или деионизированной воды.

B.1.4 Емкости тщательно моют при каждой замене морской воды.

B.1.5 В качестве корма используют культуру морских одноклеточных водорослей (десятисуточную).

В.2 Условия подготовки к тестированию Artemia salina L.

В.2.1 Оборудование и процедура получения науплиев

Для тестирования используют науплиев Artemia salina L. в возрасте одних суток (синхронизированная культура), которые получают в лаборатории из яиц.

Яйца хранят в холодильнике.

Каждую новую партию яиц проверяют на выклев. Используют яйца при выклеве не ниже 80%, что определяет в дальнейшем физиологическую чувствительность тест-организмов односуточных науплиев Artemia salina L.

Тест-организмы для тестирования получают следующим способом:

- в стакан вместимостью 500 см помещают 0,1 г сухих яиц Artemia salina L., заливают водопроводной питьевой водой и выдерживают 30 мин.

Примечание - Водопроводную питьевую воду предварительно отстаивают и аэрируют в течение одних суток;

- через 30 мин, не взбалтывая содержимого стакана, сливают слой воды над яйцами, которые осели на дно стакана, удаляя таким образом всплывшие погибшие яйца и пустые оболочки. Процедуру повторяют не менее трех раз (заполняют стакан водой и сливают воду);

- отмытые яйца от пустых оболочек заливают морской водой (см. B.1.2) необходимой минерализации (солености), значением рН 8,0-8,3 и содержанием кислорода не менее 7 мг /дм и при слабой аэрации выдерживают до выклева.

Выклев науплиев из яиц происходит через:

- 48 ч при температуре 20 °С;

- 24 ч при температуре 25 °С.