ГОСТ 31955.1-2013 (ISO 9308-1:2000) Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации (с Поправкой)
8 Проведение испытаний
8.1 Подготовка пробы воды и мембранных фильтров
Подготовку пробы воды и мембранных фильтров перед фильтрацией и посевом микроорганизмов на селективные среды проводят в соответствии с ГОСТ 31942*.
_______________
* В Российской Федерации - также с учетом требований [1] и ГОСТ Р 51426 (при необходимости разведения пробы).
Испытания проводят сразу после отбора проб.
Если пробы транспортируют и хранят при температуре окружающей среды не выше 25 °С в защищенном от света месте, то испытания начинают не позднее чем через 2 ч после отбора пробы.
В исключительных случаях пробы допускается хранить при температуре (5±3) °С не более 6 ч до начала проведения испытаний.
8.2 Фильтрация
Фильтруют 100 мл или больший объем исследуемой пробы (например, 300 мл - для воды, расфасованной в емкости), используя мембранный фильтр и оборудование для мембранной фильтрации.
При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличить количество фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например 10, 40, 100, 150 мл пробы воды). |
После окончания фильтрации мембранный фильтр помещают на соответствующую агаризованную среду по 8.3 или 8.4, обеспечивая отсутствие пузырьков воздуха под мембранным фильтром.
8.3 Инкубация и подтверждение (стандартный тест)
8.3.1 После фильтрации по 8.2 помещают мембранный фильтр на чашку Петри с лактозным ТТХ агаром с гептадецилсульфатом натрия (далее - среда с тергитолом 7), приготовленным по В.1 (приложение В), и проводят инкубацию посева микроорганизмов при температуре (36±2) °С в течение (21±3) ч. Вместо среды с тергитолом 7 допускается применять среду Эндо.
Примечания
1 Если после инкубации посева микроорганизмов в течение (21±3) ч не обнаружены типичные колонии микроорганизмов, то увеличивают продолжительность инкубации до (44±4) ч, что может привести к повышению чувствительности метода.
2 Для обнаружения Е.coli допускается использовать дополнительный мембранный фильтр для инкубации посева микроорганизмов при температуре 44 °С, что будет способствовать подавлению роста сопутствующих микроорганизмов.
8.3.2 После окончания инкубации учитывают как колонии лактозоположительных бактерий все выросшие характерные колонии микроорганизмов независимо от размера:
- на среде с тергитолом 7 - колонии с желто-оранжевой, кирпично-красной окраской, иногда с ржаво-окрашенным центром, образующие желтую окраску в среде под мембраной (отпечаток);
- на среде Эндо - колонии с темно-красной окраской с металлическим блеском или без него, слизистые с красным центром и отпечатком на оборотной стороне фильтра.
8.3.3 Оксидазный и индольный тесты
Для подтверждения наличия в пробе питьевой воды колиформных бактерий и E.coli проводят пересев всех или представительного количества (не менее 10) характерных изолированных колоний микроорганизмов (имеющих окраску по 8.3.2) в чашки Петри на неселективный триптон-соевый агар (ТСА), приготовленный по В.3 (приложение В) методом, позволяющим получить изолированные колонии, и в пробирки в триптофановый бульон, приготовленный по В.2 (приложение В).
Инкубируют посевы микроорганизмов на неселективном ТСА в чашках Петри при температуре (36±2) °С в течение (21±3) ч и выполняют оксидазный тест следующим способом.
Две, три капли свежеприготовленного по В.5.3 (приложение В) реактива для оксидазного теста помещают на фильтровальную бумагу. Затем стеклянной палочкой, деревянным аппликатором, пластиковой или платиновой бактериологической петлей растирают часть колоний микроорганизмов на обработанной реактивом фильтровальной бумаге. Появление насыщенной сине-фиолетовой окраски в течение 30 с считают положительной оксидазной реакцией, указывающей на оксидазную активность. Отсутствие изменения окраски указывает на отсутствие оксидазной активности (отрицательную оксидазную реакцию).
В случае роста на неселективном ТСА колоний разной морфологии, оксидазный тест выполняют на 2-3 колониях каждого типа.
Все колонии микроорганизмов, дающие отрицательную оксидазную реакцию, учитывают как колонии колиформных бактерий и подсчитывают их.
Инкубируют посев микроорганизмов в пробирке с триптофановым бульоном, приготовленным по В.2 (приложение В), при температуре (44,0±0,5) °С в течение (21±3) ч, после чего определяют образование индола путем добавления 0,2-0,3 мл реактива Ковача, приготовленного по В.5.1 (приложение В).