ГОСТ Р 54047-2010 Мясо и мясные продукты. Метод определения дисперсности (Переиздание)
9 Подготовка к исследованию
Отобранные образцы перед исследованием подвергают обработке в следующей последовательности: фиксация, промывка водой, уплотнение образцов, изготовление срезов, окраска срезов, заключение срезов под покровное стекло.
9.1 Фиксация образцов
Для фиксации образцы с этикетками помещают в 10%-ный нейтральный водный раствор формалина, взятый в десятикратном объеме к объему фиксируемых образцов, и плотно укупоривают. Время фиксации при комнатной температуре (21°С - 23°С) составляет 24 ч. Образец, фиксированный в достаточной степени, должен быть равномерно уплотненным и иметь одинаковый вид как с поверхности, так и на свежем разрезе.
Фиксированные образцы хранят при комнатной температуре (21°С - 23°С) в плотно закрытой посуде в 10%-ном растворе формалина в течение трех лет.
9.2 Промывка образцов
Фиксированные образцы помещают в колбочку или стакан и через вставленную стеклянную воронку промывают холодной проточной водой в течение 15 мин. В том случае, когда материал достаточно плотный, срезы изготавливают на замораживающем микротоме сразу же после промывки.
9.3 Уплотнение образцов
Для получения срезов из образцов мясопродуктов высокой рыхлости (неустойчиво удерживающие форму) после завершения фиксации их подвергают уплотнению в желатине. Для этого из фиксированных образцов вырезают кусочки объемом не более 3 см, промывают водой и пропитывают 12,5%-ным раствором желатина в течение 6 ч при температуре 37°С. Далее пропитку продолжают в термостате при температуре 37°С в 25%-ном растворе желатина в течение 12 ч. Затем кусочки раскладывают в чашки Петри, заливают их свежим 25%-ным раствором желатина и быстро охлаждают в холодильнике. После охлаждения вырезают блоки, которые уплотняют в 20%-ном растворе формалина в течение 12 ч. Перед резкой на микротоме блоки промывают в соответствии с 9.2. Хранят блоки в 10%-ном растворе формалина при комнатной температуре в течение одного года.
9.4 Изготовление срезов
9.4.1 Из фиксированных образцов из разных участков вырезают не менее трех кусочков размером 15х15х4 мм. На замораживающем микротоме готовят срезы толщиной от 10 до 30 мкм.
9.4.2 С микротомного ножа с помощью тонкой кисточки срезы переносят в кристаллизационную чашку или чашку Петри с водопроводной водой. Под неповрежденный срез быстро подводят предметное стекло (размер 24х72, толщина 1,1 мм), обработанное яичным белком с глицерином. Срез извлекают из воды на середину стекла, удерживая его там препаровальной иглой. Срез должен быть неповрежденным.
9.5 Окрашивание срезов
9.5.1 Окрашивание гематоксилин-эозином
На первом этапе срезы окрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха от 3 до 4 мин и промывают 2 мин в воде. Для удаления избытка гематоксилина срезы опускают в 1%-ный раствор соляной кислоты (солянокислая вода) до появления розовой окраски, затем в аммиачную воду до появления синего окрашивания и промывают водой в течение 2 мин. Докрашивают срезы 1%-ным водно-спиртовым раствором эозина в течение 1 мин и ополаскивают водой.
Результаты окраски: в животных тканях ядра клеток темно-синие, цитоплазма принимает красные тона различной интенсивности и оттенка. В растительных тканях выделяются клеточные оболочки, цитоплазма светлая.
9.5.2 Окрашивание красным пигментом Ж (Судан III или IV) для выявления жира
Срезы выдерживают в 70%-ном спирте от 30 до 60 с. Затем помещают в свежий профильтрованный красящий раствор Судана (до 25 мин). Затем ополаскивают в 70%-ном спирте от 3 до 5 с. Окрашенные таким образом срезы докрашивают гематоксилином и эозином в соответствии с 9.5.1. Результат окраски: жир - оранжево-красного цвета.
9.6 Заключение срезов под покровное стекло
Для заключения окрашенных срезов под покровное стекло применяют глицерин-желатин, при этом обезвоживания срезов не требуется. Используют покровные стекла размерами 18х18 и 24х24 мм при толщине 0,17 мм. После проведения исследования препараты с окраской срезов гематоксилин-эозином и Суданом хранят при комнатной температуре один год.