9.1 Окрашивание по Граму (модифицированный метод Хаккера) проводят по ГОСТ Р ИСО 7218.
Это окрашивание бактериальных клеток позволяет описать морфологию бактерий и классифицировать их на две группы на основании способности образовывать в условиях испытания фиолетовое окрашивание с кристаллическим фиолетовым.
Растворы и реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.
9.1.1 Техника окрашивания
После фиксации на предметном стекле бактериальной пленки из 18-24-часовой культуры заливают пленку раствором кристаллического фиолетового и оставляют на 1 мин для протекания реакции.
Стекло в наклонном положении осторожно промывают несколько секунд водой. Наносят на стекло раствор йода и оставляют на 1 мин для протекания реакции. Стекло в наклонном положении осторожно промывают несколько секунд водой. Стекло в наклонном положении осторожно и непрерывно промывают этанолом (95%) в течение не более 30 с до прекращения вымывания фиолетового красителя. Стекло в наклонном положении осторожно промывают водой для удаления этанола. Наносят на стекло раствор сафранина и оставляют на 10 с. Стекло в наклонном положении осторожно промывают водой. Высушивают стекло.
9.1.2 Оценка результатов
Стекло просматривают под микроскопом, используя для этого светосильный объектив с масляной иммерсией. Бактериальные клетки, окрашенные в синий или фиолетовый цвет, относят к грамположительным (Грам+); другие, окрашенные в цвета от темно-розового до красного, относят к грамотрицательным (Грам-).
У чистых культур некоторых типов бактерий в поле микроскопа могут присутствовать как грамположительные, так и грамотрицательные клетки.
9.2 Проба на каталазу
Обнаружение этого фермента, который разлагает перекись водорода (НО) на воду и кислород, проводят, используя бульонную культуру или отдельную колонию на агаровой среде. Если в конкретных стандартах на методы испытаний не установлены другие требования, то во всех случаях питательная среда не должна содержать кровь. Исключение составляет кровь, подвергшаяся термической обработке (среда с вареной кровью). В случае анаэробных бактерий перед добавлением перекиси водорода культуру выдерживают 30 с на открытом воздухе.
9.2.1 Проба на каталазу с колонией
На предметное стекло наносят отдельно две капли раствора перекиси водорода с массовой долей 3% (1:10 по объему). Отделяют колонию от среды стерильным стеклом или пластиковой палочкой (но не металлической иглой) и осторожно диспергируют ее в одной из капель. Немедленно, а также через несколько минут (но не менее 1 мин) отмечают отсутствие или образование пузырьков кислорода. В сомнительном случае покрывают обе капли предметным стеклом и сравнивают наличие пузырьков в обеих каплях. Наблюдения проводят визуально или с помощью микроскопа при малом увеличении.
9.3 Бензидиновый тест
При определении молочнокислых микроорганизмов или бактерий рода Pediococcus в случае, если в характерных колониях обнаружены грамположительные, неподвижные микроорганизмы, дающие положительную реакцию на каталазу, контролируют отсутствие цитохромов путем постановки бензидинового теста.
Для этого выросшие на чашках Петри в течение 24-48 ч колонии бактерий заливают раствором бензидина, приготовленного по 6.1.14. После того, как раствор пропитает колонии, в чашку Петри заливают такой же объем 5%-ной перекиси водорода. Молочнокислые микроорганизмы, в том числе бактерии рода Pediococcus, не содержат цитохромов. В случае присутствия цитохромов колонии окрашиваются в голубовато-зеленый или ярко-голубой цвет.
9.4 Проба на псевдокаталазу
Наличие псевдокаталазы проводят на среде по 6.9.4 с содержанием глюкозы 0,05%. Посевы инкубируют не более 5 сут при температуре (30±1) °С или не более 3 сут при температуре (37±1) °С. Определение псевдокаталазы проводят по ГОСТ 30425.