МУ 1.2.2634-10

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Г.Онищенко); Учреждением Российской академии медицинских наук "Научно-исследовательский институт питания" РАМН (В.А.Тутельян, И.В.Гмошинский, С.А.Хотимченко, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина, И.В.Аксенов, Е.А.Арианова, В.В.Бессонов, В.М.Верников, М.М.Гаппаров, Р.В.Распопов, А.А.Шумакова, В.В.Смирнова, О.Н.Тананова, О.И.Передеряев, Г.Г.Кузнецова, С.Ю.Батищева); ФГУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, B.П.Холоденко, В.А.Чугунов, Е.Н.Кобзев, И.А.Ирхина, В.Б.Родин, И.И.Мартовецкая, Е.В.Тимошинова, Н.В.Александрова); Учреждением Российской академии медицинских наук "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф.Гамалеи" РАМН (А.Л.Гинцбург, Б.С.Народицкий, М.М.Шмаров, Д.Ю.Логунов, Л.Н.Нестеренко, Н.А.Зигангирова, Ю.М.Романова, А.Ф.Мороз, М.В.Мезенцева, Д.В.Щебляков, И.Л.Тутыхина, Л.В.Черенова, А.И.Тухватулин, И.Ю.Грибова); Учреждением Российской академии наук "Центр "Биоинженерия" РАН (К.Г.Скрябин, О.А.Зейналов, Н.В.Равин, С.П.Комбарова); Учреждением Российской Академии наук "Институт биохимии им. А.Н.Баха" РАН (В.О.Попов, Б.Б.Дзантиев, А.В.Жердев, Н.В.Голуб); ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы" (С.А.Кононогов, C.С.Голубев); ООО "Интерлаб" (А.Н.Веденин, Г.В.Казыдуб).

2. РАЗРАБОТАНЫ в рамках реализации Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2010 г.г.".

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 мая 2010 г.

4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 24 мая 2010 г.

5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

I. Введение

В течение ближайших лет ожидается резкое увеличение объёмов производства во всём мире, в т.ч. в Российской Федерации, искусственных наноматериалов, в частности таких, как наночастицы оксидов кремния, титана, цинка, железа, церия, алюминия, металлические наночастицы железа, меди, кобальта, никеля, алюминия, серебра, золота, углеродные нанотрубки, фуллерены, наночастицы биополимеров и рекомбинантных вирусов. Это с неизбежностью приведёт к поступлению значительных количеств наноматериалов в окружающую среду, их накоплению в компонентах биоты и абиотических средах с последующей возможной передачей человеку.

Создание комплексной системы безопасности в процессе исследований, освоения, производства, обращения и утилизации наноматериалов в Российской Федерации требует наличия методов, позволяющих всесторонне тестировать безопасность искусственных наноматериалов и нанотехнологической продукции для широкого спектра биологических объектов. В качестве важной "мишени" воздействия наночастиц, специфически обусловленного их малыми размерами и высокоразвитой межфазной поверхностью, в настоящее время рассматриваются компоненты микробиоценоза. Воздействие наноматериалов на отдельных представителей нормальной и патологической микрофлоры толстой кишки человека может проявляться в селективной ингибиции или, напротив, усилении роста отдельных её представителей, что может вызвать дисбиотические нарушения, приводящие к развитию разнообразных негативных последствий для организма, включая угнетение функции иммунитета, патологию желудочно-кишечного тракта. Возможное мутагенное действие, которое наночастицы способны оказывать на микроорганизмы, входящие в состав нормального микробиоценоза, может приводить к появлению новых патогенных и условно-патогенных штаммов, обладающих потенциально непредсказуемыми свойствами и влиянием на макроорганизм хозяина.

Настоящие методические указания разработаны в целях внедрения единого, научно обоснованного, количественного подхода к оценке безопасности искусственных наноматериалов на основе изучения их воздействия на нормальные и транзиторные компоненты микробиоценоза толстой кишки лабораторных животных в условиях естественного (физиологического) перорального пути введения наноматериала, а также выявления у наноматериалов способности индуцировать мутагененез (в молекулярно-генетическом тесте на модельных штаммах микроорганизмов) и приобретать гены трансмиссивной антибиотикоустойчивости. Результаты проводимых тестов должны входить как неотъемлемая часть в систему оценки безопасности новых наноматериалов в ходе их разработки, регистрации, производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации.

II. Область применения

2.1. Настоящие методические указания устанавливают требования к проведению тестирования безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения на компонентах нормального микробиоценоза толстой кишки с изучением их микробиологических и молекулярно-генетических показателей.

2.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются в ходе установления безопасности наноматериалов на стадиях их производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с данными процессами.

2.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов искусственного происхождения.

2.4. Методические указания предназначены для специалистов органов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, научно-исследовательских организаций гигиенического профиля и медицинских учебных заведений, а также иных организаций и учреждений, проводящих исследования по оценке рисков, связанных с нанотехнологиями и использованием наноматериалов.

III. Общие положения

3.1. Проведение исследований по микробиологической и молекулярно-генетической оценке воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза определяются правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с положениями приказа Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении правил лабораторной практики"* (зарегистрирован Министерством юстиции российской Федерации 25 июня 2003 г., регистрационный номер 4809).

_______________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики", здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

3.2. Требования к стандартным наноматериалам.

3.2.1. Для верификации, стандартизации и калибровки методов, применяемых при определении безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах используются стандартные образцы наноматериалов (стандарты).

3.2.2. Каждый стандарт наноматериала должен быть охарактеризован на соответствие по показателям химического состава (включая наличие примесей), размеру и форме частиц, удельной площади поверхности, типу кристаллической структуры. Указанные характеристики определяются с использованием методов масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, трансмиссионной электронной микроскопии, определения изотерм адсорбции инертных газов, рентгенофазового (рентгенодифракционного) анализа. В случае стандартных образцов фуллеренов при проверке соответствия следует использовать метод обращённофазовой ВЭЖХ.

3.2.3. Каждый стандартный образец наноматериала должен быть снабжён "Паспортом безопасности наноматериалов", составленным на основе ГОСТ 30333-2007 "Паспорт безопасности химической продукции. Общие требования".

3.2.4. Стандартные образцы наноматериалов должны быть упакованы для защиты при транспортировании от загрязнения или порчи.

3.2.5. Хранение стандартных образцов наноматериалов осуществляется отдельно от остальных применяемых веществ с соблюдением условий хранения, указанных в "Паспорте безопасности наноматериалов" на протяжении всего срока годности образца.

3.2.6. Хранение и использование стандартных образцов наноматериалов осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом исследования.

3.3. Требования к используемому оборудованию.

3.3.1. Организации, проводящие определение безопасности наноматериалов в отношении нормальной микрофлоры кишечника, должны быть оснащены необходимым оборудованием, прошедшим метрологический контроль и калибровку в установленном порядке.

3.3.2. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения калибровки и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание.

3.4. Планирование и проведение исследований.

3.4.1. Определение безопасности наноматериалов в отношении нормальной микрофлоры кишечника проводится по утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в который заносятся все результаты исследований.

3.4.2. Тесты по определению безопасности наноматериалов, требующие использования лабораторных животных, проводятся только на здоровых животных, прошедших карантин в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении Правил лабораторной практики" и приказом Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных"*.

______________

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

3.4.3. Помещения для лабораторных животных должны обеспечивать изоляцию (карантин) поступающих животных для наблюдения и выбраковки больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций; позволять осуществлять раздельное содержание как различных видов животных, так и различных групп животных одного вида, соответствовать санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям.

3.4.4. Корма, оборудование и инвентарь для ухода за животными необходимо хранить в помещениях, изолированных от мест содержания животных. Помещения, корма и инвентарь должны соответствовать требованиям, установленным в приказе Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 "Об утверждении Правил лабораторной практики" и приказе Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных" и СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

3.4.5. Исследования безопасности наноматериалов на животных проводятся в соответствии с установленными правилами. Исполнителем должен быть обеспечен контроль за соблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных в соответствии с утверждённым протоколом (п.3.4.7).

3.4.6. Корма и вода для животных должны обеспечивать пищевые потребности в соответствии с протоколом исследования, быть свободными от патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на результаты исследования.

3.4.7. Данные исследования безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника заносятся в протокол, в котором отражены цели работы и методы, используемые для достижения этих целей.

Протокол исследования утверждается руководителем организации, проводящей исследования, и включает: цель и задачи исследования, имеющиеся сведения о тестируемом наноматериале (физические, химические, биологические, токсикологические свойства), используемые стандарты, схему проведения тестирования и её обоснование, методы введения наноматериала в биологический объект, применяемые дозы наноматериала, методы исследования, определяемые показатели, результаты исследований, метрологическую характеристику используемого метода анализа, статистическую обработку результатов исследования, заключение, список используемой литературы.

3.4.8. Вносимые изменения в протокол исследования утверждаются руководителем исследования, а отклонения от протокола (незапланированные события, непредвиденные обстоятельства и т.д.) записываются, пронумеровываются, подписываются руководителем исследования, датируются в приложении с указанием причин.

3.5. Требования к оформлению отчета.

3.5.1. По окончании проведенных исследований безопасности наноматериалов по влиянию на микробиологические и молекулярно-генетические показатели компонентов микробиоценоза оформляется отчет, в котором должны быть представлены: название, адрес организации, даты начала и завершения исследований, цель и задачи исследования; характеристика тестируемого наноматериала, включая имеющиеся сведения о физических, химических, биологических, токсикологических свойствах; перечень протестированных образцов наноматериала и применяемых стандартов, метод введения наноматериала в организм животного, схема проведения исследования, описание методов статистической обработки результатов, результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой, и комментариев к ним, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы.

3.5.2. Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.6. Система обеспечения качества исследований по определению безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах.

3.6.1. Контроль за качеством проведения исследований по определению безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника включает в себя оформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием для каждого исследования руководителя и заказчика, названия определяемого наноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий момент времени, оценку протоколов и методов исследования на соответствие правилам лабораторной практики, мониторинг текущих исследований, отчет о проведенных проверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.6.2. Для осуществления контроля качества руководитель организации, проводящей тестирование безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, назначает, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, ответственных лиц за мониторинг исследования из числа сотрудников, не участвующих в исследовании.

3.7. Стандартные операционные процедуры.

3.7.1. Стандартные операционные процедуры разрабатываются организацией, проводящей исследования безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, на все производственные операции, включая: поступление, идентификацию, маркировку, отбор, обработку проб, использование и хранение исследуемых проб, хранение и аттестацию стандартов; обслуживание и калибровку измерительных приборов и оборудования; ведение тест-систем и их поддержание в функциональном состоянии; приготовление реактивов, ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизацию наноматериалов, содержащих их образцов (если это необходимо) и использованных компонентов тест-систем, осуществление программы по обеспечению качества, и утверждаются руководителем организации.

3.7.2. Соблюдение стандартных операционных процедур осуществляется в целях обеспечения безопасности исследования, качества, достоверности и воспроизводимости его результатов.

3.7.3. Отклонения от стандартных операционных процедур должны быть документально оформлены и согласованы с руководителем исследования.

3.7.4. Организация, проводящая исследование по определению безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, обязана:

иметь утвержденный порядок приема и учета поступления анализируемых проб и стандартов наноматериалов;

проводить учет анализируемых проб и стандартов наноматериалов при поступлении, расходовании, возврате заказчику или их утилизации;

принимать меры по обеспечению идентификации исследуемых веществ (указание на этикетке названия, химической формулы, номера серии, даты выпуска, условий хранения и сроков годности) и их стабильности на протяжении всего исследования. Для образцов наноматериалов на этикетке дополнительно должны указываться степень дисперсности, размер, форма частиц, при необходимости, удельная площадь поверхности и кристаллическая структура.

3.8. Меры конфиденциальности.

3.8.1. Сотрудники, принимающие участие в проведении исследований безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.8.2. Организация, проводящая исследования по определению безопасности наноматериалов, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

IV. Метод оценки безопасности наноматериалов на нормальной микрофлоре кишечника в условиях in vivo

4.1. Принцип метода

Оценку влияния наноматериалов на нормальную микрофлору кишечника в условиях in vivo проводят на основании изучения видового состава и количественных уровней основных микробных популяций микробиоценоза кишечника, их функциональной активности путем посевов фекальных масс или содержимого толстого кишечника лабораторных животных, которым внутрижелудочно вводят образцы наноматериалов, при сравнении с животными, которым вводят традиционный аналог наноматериала, и с контрольными животными. В качестве групп сравнения (контроль) используют животных, которым вводят дистиллированную воду или среду - носитель наноматериала.

Проводят изучение не менее 4 групп и родов защитных популяций микрофлоры (лактобактерии, бифидобактерии, бактероиды, лактозоферментирующие энтеробактерии) и 5 групп и родов транзиторных (условно-патогенных) представителей микробиоты (энтеробактерии, стафилококки, энтерококки, дрожжевые и дрожжеподобные грибы, споровые анаэробы и др.) на соответствующих дифференциально-диагностических и селективных средах.

Количественный учет бифидобактерии проводят на тиогликолевой среде или среде Блаурокка; лактобацилл - на среде МРС; энтеробактерий - на среде Эндо и цитратном агаре. Содержание стафилококков определяют на желточно-солевом агаре и среде Байрд-Паркера; стрептококков - на кровяном агаре; энтерококков - на среде МИС; количество сульфитредуцирующих клостридий - на железосульфитной среде; дрожжей - на среде Сабуро; плесневых грибов - на среде Сабуро или Чапека.

У штаммов энтеробактерий, стафилококков проводят определение таксономической принадлежности до уровня вида с использованием системы мультимикротестов API для биохимической идентификации, производства фирмы "Bio Merieux" (Api 10S, Api 20E, Api RapiD 20E, Api Staph), и/или классических методов исследования.

Содержание определенных групп, родов, видов микроорганизмов (плотность популяций) выражают в десятичном логарифме числа колониеобразующих единиц на 1 г сырой массы фекалий или кишечного содержимого (lg KOE/г).

Помимо количественных характеристик определяют наличие факторов патогенности, таких как гемолитическая активность энтеробактерий, стафилококков, энтерококков, лецитиназная и коагулазная активность стафилококков, способность к образованию хламидоспор и псевдомицелия дрожжеподобными грибами.

Определение функциональных свойств (антагонистической активности) популяций бифидобактерий, выделенных из кишечника лабораторных животных, проводят по степени их кислотообразующей активности в среде культивирования.